抗B型肉毒毒素鼠源中和抗体快速制备及其免疫学活性的初步研究

摘要

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素，属神经强毒，人类的肉毒中毒主是由A,B和E引起。是目前已知毒性最强的细菌蛋白质之一，是重要的生物战剂。本论文以定向免疫和噬菌体展示技术为平台，探索了一种快速制备及筛选鼠源抗体的技术路线，将筛选到的高亲和力抗体直接进行中和活性实验，将抗体基因克隆、高亲和力抗体富集和抗体筛选在噬菌体水平一步完成，简便快速，研究周期短。为生物毒素新型抗毒素的制备提供新的研究思路。 本研究中首先克隆了B型肉毒毒素重链C端基因，与已知序列同源性达99％。为了获得重组蛋白，构建了pET22重组质粒载体，诱导表达后未得到目的蛋白。随后构建pET32重组质粒，获得了BoNTB/Hc的融合蛋白。对引物进行改构后，最终获得了以包含体形式存在的BoNTB/HcN端修饰蛋白，并用金属螯和层析法进行了初步纯化和鉴定。进一步对其免疫学活性进行初步研究，结果表明重链Hc免疫后的BALB/c小鼠可以在一定程度上抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击，为B型肉毒毒素疫苗的研究奠定了基础。同时制备了卵黄检测抗体(IgY)，抗体效价达104以上。 用重组表达并纯化的BoNTB/Hc免疫小鼠，从其脾淋巴细胞中提取全套抗体可变区基因，分别构建scFv和Fab段噬菌体抗体文库，库容分别为6.72×107cfu和5.69×106cfu。以纯化的BoNTB/Hc为抗原，对抗体库进行富集筛选，并以BoNT/B为抗原进一步鉴定特异性抗体，最终获得与BoNT/B结合能力较强的scFv抗体2个，分别命名为S3和S24，VH属于VH2家族，Vκ分别属于Vk2和Vκ1家族。Fab抗体1个，命名为F38，VH属于VH1家族，Vκ属于Vκ2家族。 重组抗体免疫学保护试验表明，抗B型肉毒毒素的噬菌体抗体S3对BoNT/B致死作用的保护性较强，能够在一定程度上抵抗10LD50(i.p.)的致死作用，S24次之，F38较弱。未观测到S3，S24和F38三者的明显叠加作用。挑选作用较强的S3，进行了体外重组制备，Westernblot鉴定初步纯化的scFv抗体蛋白可以和BoNTB/Hc发生特异性反应，小鼠试验未见重组scFv抗体蛋白的明显保护作用。

目录

引言

第一部分B型肉毒毒素重链C端基因的克隆表达与保护作用的初步研究

1材料和方法

1.1材料

1.2 B型肉毒毒素重链C-端基因片段的克隆表达及纯化鉴定

1.3 BoNTB/Hc对小鼠免疫保护作用的初步评价

1.4抗B型肉毒毒素重链C-端基因鸡卵黄抗体(IgY)的制备

2结果

2.1 BoNTB/Hc片段的PCR扩增及序列测定

2.2 BoNTB/Hc天然序列在大肠杆菌中的表达

2.3 BoNTB/Hc融合蛋白在大肠杆菌中的表达及变复性研究

2.4 BoNTB/Hc N端修饰蛋白在大肠杆菌中的表达

2.5金属螯和层析法对BoNTB/Hc蛋白的纯化及鉴定

2.6 BoNTB/Hc免疫保护作用的初步评价

2.7抗B型肉毒毒素重链C-端基因鸡卵黄抗体(IgY)的制备

3讨论

第二部分鼠源抗BoNT/B抗体库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

一鼠源抗BoNTB/Hc噬菌体展示抗体库的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

二抗B型肉毒毒素噬菌体抗体的体外亲和筛选及序列分析

1材料与方法

2结果

3讨论

三抗B型肉毒毒素鼠源抗体免疫学活性的初步研究

1材料与方法

2结果

3讨论

总结

综述

参考文献

致谢

英文缩略词表

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