定向结构软骨支架复合骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的研究

摘要

关节软骨具有良好的弹性，能够有效减少负重及运动对关节造成的挤压和冲击；同时也有着极佳的润滑作用，使关节面间的摩擦降至最低，有效减少了关节磨损。关节软骨由于缺乏血管，一旦受损其依靠自身能力修复非常困难，而临床使用的外科治疗方法难以获得长期确切疗效，因此采用组织工程技术重建受损软骨逐步受到青睐。软骨组织工程涵盖种子细胞、支架材料、生物因子及组织构建等多方面的考虑与选择，是一项复杂而精密的系统工程。目前软骨组织工程的开展仍受到一定限制，主要是由于对软骨组织结构、机械性能的了解存在局限，导致组织工程化软骨力学性能难以达到临床应用的要求。从整体结构上看，正常关节软骨内的软骨细胞和胶原纤维呈柱状排列并与关节表面垂直，这种具有方向性的组织结构对于维持关节软骨的力学性能非常关键。因此，模拟正常关节软骨定向排列结构，制备具有一定方向性的软骨支架并利用其构建组织工程软骨，必能更好的促进关节软骨缺损修复与新生软骨力学性能重建。近年来，已有研究者利用定向软骨支架在体外成功构建了类软骨组织，但体内应用的报道并不多见。因而，利用软骨基质材料制备定向结构软骨支架，在动物体内构建组织工程软骨，并进一步应用于关节软骨缺损修复就显得尤为必要了。
　　本实验采用温度梯度热诱导相分离（Temperaturegradient-guidedthermal-inducedphaseseparation,TIPS）技术，利用人工提取牛软骨细胞外基质材料制备具了有垂直平行排列微管结构的定向软骨支架。提取兔骨髓基质干细胞（Bonemarrowstemcells,BMSCs）并利用转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β,TGF-β）诱导其向软骨分化，分别接种定向支架和非定向支架后将两组支架-软骨诱导BMSCs复合物植入裸鼠皮下构建组织工程软骨。结果显示两组支架-细胞复合物在体内均能成功构建具有稳定软骨表型的组织工程化软骨，在总DNA、总glycosaminoglycan(GAG)及总胶原等生物化学组成无明显差异的情况下，定向组织工程软骨较非定向新生软骨具有更好的力学性能，提示在体内培养条件下定向结构对于组织工程软骨力学性能的提升具有决定性意义。最后将定向支架-BMSCs复合物植入兔关节软骨全层缺损，经过最长24W培养后取材进行组织学、生物化学及生物力学测试。结果显示定向组及非定向组软骨缺损均获得了较为满意的修复，关节表面平坦光滑；组织学染色证实软骨基质分泌旺盛并有典型软骨细胞形成，组织结构类似正常关节软骨；定向组新生软骨压缩弹性模量高于非定向组，并且其杨氏模量数值较为接近正常软骨。实验结果表明，定向支架-BMSCs复合物能够有效修复兔关节软骨全层缺损，并能获得更好的机械力学性能，具有重要的临床实际应用价值。
　　第一部分定向结构软骨支架的制备
　　理想的软骨组织工程支架不仅应当具有良好生物相容性，也应具备较高强度以适应软骨修复的力学要求，而模拟正常软骨各向异性结构设计的定向软骨支架就可以有效提升支架的机械性能。本实验利用物理粉碎与化学脱细胞相结合的方法提取了牛关节软骨细胞外基质(cartilageextracellularmatrix,ECM)，采用温度梯度热诱导相分离(TIPS)技术制备了具有定向微管结构的软骨支架，使用京尼平对支架进行交联，并对支架的物理性能和力学性能进行了检测。结果显示定向软骨支架与非定向支架在孔隙直径、孔隙率、密度及吸水性等方面无显著差异，但定向支架的压缩弹性模量显著高于非定向支架，主要是由于定向支架平行排列的微管管壁均匀、厚重，能够承载更多的压缩负荷所致。实验结果表明，定向软骨支架具有适合软骨细胞生长的物理特性，并拥有更加优秀的力学强度，能够更好满足软骨修复对支架力学性能的要求。
　　第二部分体内构建定向结构组织工程软骨的研究
　　近年来有关定向软骨支架的研究主要集中在提升支架力学性能和改善支架体外生物相容性等方面，尚未有体内应用的报道出现，因而利用定向支架在体内构建组织工程软骨就显得极具研究价值。本实验采用转化生长因子-β（TGF-β）诱导骨髓基质干细胞（BMSCs）向成软骨方向分化，将其接种到定向及非定向支架后在体外静态培养。利用MTT法检测细胞在支架上的增殖，通过扫描电镜（Scanningelectronicmicroscope,SEM）观察细胞在支架上的分布状况及形态变化。体外培养1W后将细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下，4W后取材对形成的组织工程软骨进行组织学、生物化学及生物力学检测。SEM观察可见软骨诱导BMSCs在两组软骨支架上粘附良好，定向支架上有大量圆形细胞粘附于定向排列微管的侧壁，细胞分布具有明显的规律性和方向性，并能沿着贯通的微管向支架内部迁移。MTT法检测显示在整个体外培养周期内两组支架上的细胞数量皆有显著提升。在3d～9d培养过程中定向组细胞增殖高于非定向支架组，差异有统计学意义（P<0.05）；然而在第11d和13d两组支架细胞增殖再次趋于接近，细胞数量无显著性差异。
　　裸鼠体内培养4W后构建的定向及非定向组织工程软骨番红O染色、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化均为阳性，I型胶原免疫组化阴性。在定向支架组中可见大量规则平行排列的粗大胶原纤维，并有大量圆形的软骨陷窝沿胶原基质纵向分布；在非定向支架组中可见大量均匀片状细胞外基质形成，有大量圆形的软骨陷窝随机分布其中。在整个体内培养周期中，两组新生软骨总DNA、总GAG及总胶原含量随时间延长而逐渐上升，显示出旺盛的细胞增殖及软骨基质分泌非趋势。在2W和4W两个时间点，两组新生软骨总DNA、总GAG及总胶原含量无显著性差异。定向组新生软骨杨氏模量在2W及4W时均高于非定向组新生软骨，差异有统计学意义（P<0.05）。在培养4W后，定向组及非定向组新生软骨杨氏模量分别达到正常关节软骨的42.9％和23.0％。实验结果表明，在体内培养条件下定向支架能够显著改善组织工程软骨结构并能有效提高新生软骨力学性能，因而具有良好的软骨组织工程应用前景。
　　第三部分定向软骨支架复合骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的研究
　　利用组织工程技术修复软骨损伤已开展多年，而使用具有较强机械性能软骨支架以促进新生软骨力学功能恢复的研究逐渐受到重视。本实验提取兔自体BMSCs扩增后接种定向及非定向支架，将BMSCs-软骨支架复合物植入兔关节软骨全层缺损，分别在6W、12W及24W后取材，通过对新生软骨组织进行大体观察、显微计算机断层扫描（Micro-CT）、组织学染色、O’Driscoll组织学评分、生物化学检验及生物力学测试，验证其修复关节软骨缺损的可能性。大体观察显示定向组及非定向组软骨缺损均获得了较为满意的修复，关节表面较为平坦光滑，与周围正常软骨无明显界限。Micro-CT重建显示关节表面平整，软骨厚度适中。组织学染色显示定向支架组及非定向支架组新生组织随着培养时间延长逐步获得了较为稳定的软骨表型，出现了典型的软骨细胞和软骨陷窝，新生软骨结构和厚度均接近周围正常软骨。两组新生软骨番红O染色、甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化均呈阳性。O’Driscoll量表组织学评估显示两组新生软骨均获得较高分数，且两组间无明显差异。两组新生软骨总DNA、总GAG及总胶原含量均无明显差异，两组的各项生物化学检测数据均高于空白对照组，两组新生软骨总DNA及总胶原含量接近正常关节软骨，但总GAG含量较低。定向组新生软骨压缩弹性模量高于非定向组，并且其杨氏模量数值较为接近正常软骨，显示其力学性能恢复良好。实验结果表明，定向支架-BMSCs复合物能够有效修复兔关节软骨全层缺损，并能获得更好的机械力学性能，具有重要的临床实际应用价值。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文 献 回 顾

1 关节软骨的构成和性能

2 关节软骨修复

3 软骨组织工程

正文

第一部分 定向结构软骨支架的制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验一附图

第二部分 体内构建定向结构组织工程软骨的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二附图

第三部分 定向软骨支架复合骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三附图

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢