色素上皮衍生因子对缺氧复氧后血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响的实验性研究

摘要

研究背景：
　　我国有心肌梗死（MI）患者超过四百万，并且每年以至少五十万的速度在增长，这一疾病严重威胁着人民的生命和健康。目前，传统的内、外科疗法对冠状动脉弥漫性狭窄或心肌细胞大量坏死已经形成大量瘢痕的患者疗效不佳。近年来，干细胞移植为治疗MI带来了新的希望。在众多干细胞中，因为骨髓基质干细胞（MSCs）易于分离、培养、扩增、免疫原性低，可向损伤部位趋化等生物学特性而成为理想的移植细胞，是目前国际上研究的热点。越来越多的研究表明MSCs在MI处主要通过旁分泌作用促进MI的恢复。即MSCs可以在梗死部位分泌大量的活性因子发挥多种生物学作用。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是 MSCs分泌的一种重要的细胞因子，属于无蛋白酶抑制剂功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，广泛存在于人的组织中，具有营养和保护神经、抑制肿瘤、抑制血管生成、抗氧化、抗炎和抑制血栓形成等特性。其中，PEDF抑制血管生成的功能引起了广泛的关注，但其抑制新生血管生成的机理尚未完全明确。前期研究都集中于对MSCs分泌的促进血管生成因子的生物学行为对MI病理过程作用及机制的研究，但对于抑制血管生成因子的研究鲜有报道。本研究通过缺氧/复氧(H/R)模型模拟缺血再灌注损伤，初步探讨重组人源性PEDF对缺氧/复氧后血管平滑肌细胞（VSMCs）和增殖及凋亡的影响及其机制，为MSCs移植治疗 MI带来新的靶点。
　　研究方法：
　　以组织贴块法原代培养VSMCs，随机分为3组，即对照组、H/R模型组及模型+PEDF组。模型+PEDF组又按 PEDF的浓度（50、100、200及400ng/ml）分为4组。用MTT比色法检测VSMCs增殖的变化；用Hoechst/PI双染色法和流式细胞仪法（FCM）检测VSMCs的凋亡；用Western Blot测定VSMCs凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。
　　研究结果：
　　1．MTT比色法检测显示：H/R可以促进VSMCs增殖，经PEDF处理后，能抑制其增殖，以浓度为200ng/ml效果最为显著(P<0.01)。
　　2．Hoechst/PI双染色法和流式细胞术（FCM）检测显示：经200ng/ml PEDF+H/R处理后，VSMCs凋亡率较对照组和H/R组明显增高(P<0.01)
　　3．Western Blot检测显示：VSMCs经200ng/ml的PEDF+H/R处理，能够下调Bcl-2蛋白表达并上调Bax蛋白表达(P<0.01)。
　　结论：
　　1．H/R能够诱导VSMCs的异常增殖，PEDF能够抑制H/R后VSMCs的异常增殖，促进其凋亡，其抑制效果最显著的PEDF浓度是200ng/ml。但是，PEDF对常氧条件培养的VSMCs增殖没有抑制作用，可能会使PEDF的应用更加广泛。
　　2．PEDF诱导VSMCs的凋亡，其通路可能是通过上调凋亡相关蛋白Bax表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。是否还有其他通路有待进一步研究证实。
　　3．通过我们采用的组织贴块法培养的原代VSMCs纯度高，细胞生长状态好，操作简单，成功率高。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文 献 回 顾

一、国内外 MSCs 移植治疗 MI 的研究现状和分析

二、PEDF 的研究进展及其与心血管疾病的相关性

正文

第一部分 血管平滑肌细胞培养、传代及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 色素上皮衍生因子对缺氧复氧血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

个人简历和研究成果

致谢