携带GFP逆转录病毒载体的构建及其在癫痫鼠海马神经发生中的应用研究

摘要

癫痫是一种慢性神经系统常见疾病，以大脑神经元异常放电所致的短暂性脑功能障碍为特征。近年来对癫痫发病机制的研究取得了很多进展并提出众多假说但癫痫具体发病机制目前仍不明确。大量研究表明癫痫发作后的神经发生异常不但和癫痫相关的认知功能障碍有关，而且与海马硬化、突触重塑和异常神经环路形成等导致自发、复发性癫痫发作的病理进程有关。因此癫痫发作后的异常神经发生成为近年来癫痫研究领域内的热点。
　　通过免疫组化的方法，课题组在前期研究中发现：大鼠癫痫发作后，海马亚颗粒增生带产生的新生神细胞异常迁移至门区，形成异位神经元。此外，通过离体研究，我们发现促炎性因子白介素-1β对离体培养神经元的迁移具有引导作用。这些结果提示癫痫发作可能导致IL-1β表达上调，进而导致新生神经元迁移异常，形成海马门区的异位神经元，最终成为癫痫反复发作的根源之一。但目前缺乏更多的实验室证据支持这一结论。逆转录病毒载体为一种常用的分子生物学工具，利用携带GFP的逆转录病毒载体标记海马新生神经细胞可以清晰的观察到新生神经细胞的形态结构并可长期观察，故在研究癫痫发作对海马神经发生的影响方面与常规方法相比具有很大优势。因此，我们设计并完成了本课题，以期进一步验证癫痫发作后新生细胞的迁移模式并对其可能的分子机制进行初步探讨。
　　目的：
　　构建携带 GFP的重组逆转录病毒载体并用以研究癫痫发作对大鼠海马神经发生的影响；观察癫痫发作后大鼠海马区IL-1βmRNA及蛋白表达的变化；构建针对IL1R1的siRNA重组逆转录病毒。
　　方法：
　　1、利用MSCV-IRES-GFP质粒，通过质粒扩增、提取、病毒包装等步骤构建携带绿色荧光（GFP）的逆转录病毒用于后续实验。
　　2、建立氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型，建模后一周通过大脑立体定位注射技术将逆转录病毒注入大鼠海马门区，并以正常大鼠作为对照，通过免疫荧光法观察逆转录标记新生细胞的迁移并探讨 IL-1β的作用；通过Real-time PCR和Western blot等技术观察IL-1βmRNA和蛋白表达的变化。
　　3、基于MSCV-IRES-GFP构建针对IL1R1的siRNA重组质粒，通过质粒扩增、提取、病毒包装等步骤构建针对IL-1R1的siRNA重组逆转录病毒。
　　结果：
　　1、构建含有GFP的逆转录病毒载体，包装完成后感染细胞，可观察到48小时后约有80％-90％的细胞表达GFP，说明病毒包装成功。
　　2、对照组大鼠海马亚颗粒增生带产生的新生细胞向分子细胞层迁移，模型组大鼠在癫痫发作后，海马新生细胞数目增多且异常迁往齿状回门区，部分细胞顶树突伸向门区。与对照组相比，癫痫模型组大鼠海马 IL-1β的mRNA及蛋白表达水平均出现明显的上调（p<0.05）。
　　3、测序结果证实针对IL1R1的siRNA重组质粒构建成功，包装成重组逆转录病毒后，细胞感染实验显示48小时后90％细胞被逆转录病毒成功感染；Real-time PCR检测发现与正常细胞相比病毒感染细胞内 IL-1R1的mRNA表达降低。
　　结论：
　　1、癫痫发作可促进大鼠海马内的细胞增殖，并可导致逆转录病毒标记的新生细胞异常迁往齿状回门区形成异位神经元，提示其可能是癫痫发生的根源之一。
　　2、癫痫发作后大鼠海马IL-1β的mRNA及蛋白表达水平均出现明显的上调，且成功构建针对IL1R1的siRNA重组逆转录病毒，为下一步研究癫痫发作后细胞迁移异常的分子机制奠定了基础。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1 癫痫概述

2 癫痫的发病机制

3 哺乳动物脑内的神经发生

4 癫痫与海马神经发生

5 癫痫与炎症

正文

实验一 逆转录病毒的包装及验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 癫痫发作后新生神经细胞迁移的观察

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 癫痫鼠海马 IL-1β 的表达及靶向 IL-1R1 的siRNA 逆转录病毒载体的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢