转录因子Nrf2对脂多糖诱导Kupffer细胞NF-κB活化的抑制作用及机制研究

摘要

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指组织学改变与酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)相似,但排除过多酒精摄入(每周超过210g,连续五年以上)或其他特殊病因(如营养不良、药物、病毒等)的一种临床病理综合症[1],其包括广泛的疾病谱:从单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝硬化到肝癌[2,3]。在欧美等西方国家发达国家,普通成人NAFLD患病率为20％~33%。在美国,其在儿童和青少年中的发生率估计在5%~10%,在肥胖人群中可以高达70%[1]。近年,NAFLD在我国人群发病率逐年增加,已成为主要慢性肝病之一。然而到目前为止其致病机制尚未完全阐明。
　　近年,大量文献报道肠道微生态和氧化应激在NAFLD发病中起重要作用[4-9]。肥胖或高脂饮食引起肠道菌群失衡产生代谢性内毒素血症,大量内毒素经门脉系统进入肝脏,刺激肝脏库普弗细胞(kupffercells,KCs)产生大量ROS而导致氧化应激,进一步诱导NF-κB活化和肝脏炎症,最终触发胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)和NAFLD的发生,而选择性敲除KCs,即可消除这种效应。这些发现显然不同于经典的“二次打击”学说[11-15],证实内毒素诱导KCs活化可能是NAFLD发病的始发环节。因此,抑制KCs氧化应激及下游NF-κB活化可能有助于防治NAFLD。
　　转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)是细胞抵御内外源性氧化应激的中心环节,它可以与抗氧化反应元件(antioxidant-responseelement,ARE)结合,通过上调抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达而降低氧化应激损伤[16,17]。我们前期的研究证实,姜黄素可以通过诱导Nrf2核转位对NASH发挥保护作用。但Nrf2是否可以通过抑制KCs氧化应激水平,并进一步降低下游NF-κB信号通路活化而延缓NAFLD的发生,目前尚不明确。
　　因此本实验利用姜黄素诱导Nrf2核转位,探讨其对内毒素诱导KCs氧化应激及下游NF-κB信号通路活化和炎症反应的作用,从而从KCs角度阐明Nrf2对NAFLD的保护作用及机制。
　　目的:
　　体外通过LPS刺激KCs产生氧化应激,观察NF-κB的表达及下游炎症因子变化;通过姜黄素干预,研究Nrf2对LPS诱导KCs时氧化应激水平、II相酶(HO-1)表达、NF-κB活化及下游炎症因子表达的影响,从而为阐明NAFLD的发病机制提供实验和理论依据。
　　方法:
　　1.SD大鼠肝脏KCs的分离、培养与鉴定。
　　2.将KCs分为对照组与LPS组,对照组常规培养,LPS组给予LPS刺激。酶标法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;细胞免疫荧光法检测NF-κB的核转位情况,Westernblot法检测NF-κB(p65)、IκBα、p-IκBα表达变化,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达变化。
　　3.将KCs分为对照组、LPS组和姜黄素组,对照组常规培养,LPS组给予LPS刺激,姜黄素组先给予姜黄素干预,余处理同LPS组。细胞免疫荧光法检测Nrf2的核转位情况,RT-PCR法检测抗氧化酶HO-1的表达,余指标同上。
　　结果:
　　1.在密度梯度离心法基础上加以改良,分离、培养并鉴定KCs,证明用上述方法成功地获取KCs。
　　2.LPS组MDA水平较对照组显著增高(P<0.05),而GSH水平显著低于对照组(P<0.05)。细胞免疫荧光和WesternBlot结果显示,与对照组相比,LPS组胞核NF–κB表达显著升高;ELISA结果显示,LPS组TNF–α、IL–1β和IL–6表达显著高于对照组(P<0.05)。
　　3.酶标法结果显示,LPS组中MDA表达水平明显高于对照组(P<0.05),姜黄素组显著低于LPS组(P<0.05)但仍显著高于对照组;LPS组GSH表达水平显著低于对照组(P<0.05),姜黄素组GSH表达显著高于LPS组(P<0.05),但显著低于对照组(P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示,LPS组胞核Nrf2表达高于对照组,而姜黄素组高于LPS组;RT–PCR法结果显示,LPS组HO–1mRNA表达显著高于对照组(P<0.05),姜黄素组HO–1mRNA表达显著高于LPS组(P<0.05);WesternBlot的结果显示,LPS组NF–κBp65表达显著高于对照组(P<0.05),而显著低于姜黄素组(P<0.05);ELISA法结果显示,LPS组TNF–α、IL–1β和IL–6表达显著高于对照组(P<0.05),但较姜黄素组显著降低(P<0.05)。
　　结论:
　　本实验在密度梯度离心法基础上加以改良,分离、培养及鉴定大鼠KCs,成功获取KCs;证实LPS能够增加KCs内氧化应激水平,促进KCs的NF-κB的核转位及下游炎症因子TNF–α、IL–1β和IL–6表达,同时证实姜黄素引起的Nrf2的核转位能够通过上调HO-1的表达降低氧化应激水平、从而抑制NF-κB的活化及下游炎性因子的分泌,为以Nrf2和肝脏KCs为靶点防治NAFLD提供新的理论依据和实验基础。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1 非酒精性脂肪性肝病

2 肝脏KCs

3 内毒素

4 核转录因子NF-κB

5 Nrf2-Keap1系统

6 姜黄素与Nrf2

正文

实验一 大鼠肝脏Kupffer细胞的分离与鉴定

引言

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 LPS对Kupffer细胞氧化应激和NF-κB的影响

引言

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 Nrf2对LPS诱导Kupffer细胞氧化应激和

引言

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢