在体生物发光成像术观察骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的形成

摘要

研究背景:脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)为年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)等多种眼底疾病视力丧失的主要原因。在CNV进程中血管发生和血管生成同时发生,最终可导致严重且不可逆的视力丧失。CNV的发病机理还未完全阐明,涉及RPE-Bruch膜-光感受器复合体的衰老,氧化性损伤的积累以及外层视网膜局部缺血的发展。
　　我研究组前期实验通过建立C57-GFP嵌合体小鼠观察了在CNV发生发展过程中,骨髓来源细胞(Bonemarrowderivedcells,BMCs)在CNV聚集、分化和表达蛋白情况,证实BMCs在CNV局部可分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、上皮细胞及成纤维细胞,这些细胞除了参与形成新生血管外,还可分泌促血管形成因子如VEGF和bFGF,表明BMCs也在一定程度上调控着CNV的严重程度。在相同强度的诱发因素下,高龄小鼠生成的CNV较低龄小鼠更为严重,提示我们年龄因素可能使BMCs对损伤做出超常反应,从而导致病理性新生血管的生成更为严重。还有研究表明,高龄鼠骨髓细胞可能存在有功能异常,导致其分化能力发生改变,从而促进生成病理性组织。近期有研究发现,高龄鼠BMCs的增殖能力受损,并有潜在的新生血管形成趋势。在低氧预处理后,其血管生成基因表达增加,因此是否移植高龄者BMCs会影响其临床治疗潜力?
　　组织病理学检测是评价注射细胞分布、移植后成活率及其分化状态的最主要方法,但无法实时和在活体内动态进行观测和评价。生物发光成像技术(bioluminescenceimaging,BLI)可以在体、实时的示踪各类细胞的存活、归巢和分化情况,还可评估骨髓移植后受体的存活状态和被移植细胞的存活状态,是一项尤其适用于小动物的新兴分子影像学技术。
　　目的和内容:(1)评价BLI监测小鼠体内BMCs参与CNV形成过程的可行性,为BLI研究CNV发生机制打基础;(2)利用BLI观察不同年龄BMCs参与CNV形成的全过程并结合组织学分析,探究年龄如何影响BMCs参与形成CNV。
　　方法:(1)将荧光素酶-绿色荧光蛋白(Fluc-GFP)双转基因小鼠的骨髓移植到野生型C57小鼠,将嵌合度>85％的嵌合体小鼠并分为两组:实验组利用532nm激光建立小鼠CNV模型,对照组不行CNV造模。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天,利用小动物成像系统(IVISKinetics)对两组小鼠进行BLI观察,高灵敏度CCD采集图像,活体成像软件系统(LivingImagingVersion4.0)对选取的眼部光学统计区域(Regionsofinterest,ROIs)进行分析。(2)小鼠分为两组,年龄性别匹配,实验组为Fluc-GFP双转基因老年小鼠(18月龄)与野生型C57成年小鼠(4月龄)的骨髓移植建立的CNV嵌合体小鼠,对照组为Fluc-GFP双转基因成年小鼠(4月龄)与野生型C57成年小鼠(4月龄)的骨髓移植建立的CNV嵌合体小鼠。将嵌合度>85%的嵌合体小鼠纳入实验,利用532nm激光建立两组小鼠CNV模型。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天,利用小动物成像系统(IVISKinetics)对两组小鼠进行BLI观察,高灵敏度CCD采集图像,活体成像软件系统(LivingImagingVersion4.0)对选取的眼部光学统计区域(Regionsofinterest,ROIs)进行分析。择激光后第14天为组织学实验的观察点,从组织学角度分析CNV区域的BMCs,两组小鼠同步进行,利用图像分析软件(Photoshopcs4)来测量各个样本中CNV的最大直径和厚度,以像素(pixel)为单位进行表示。
　　结果:(1)造模后第1天,实验组小鼠即有大量BMCs趋化至CNV部位,前3天趋化至CNV部位的BMCs数量增长最快,第7天病变部位BMCs数量达峰值,第14天病变部位BMCs数量降至最低,随后稍有增加,第28天以后保持稳定。对照组小鼠在相应时间点眼内BMCs数量较为稳定,且明显低于实验组小鼠(P<0.05)。(2)实验组小鼠(老年小鼠骨髓移植给成年小鼠)趋化至CNV部位的BMCs数量在CNV建模后14天内明显高于成年小鼠骨髓移植给成年小鼠的对照组(P<0.05),14天后两组小鼠趋化至CNV部位的BMCs数量无明显差别(P>0.05)。在CNV造模后的第1天至第7天,实验组小鼠趋化至CNV部位的BMCs数量迅速上升,7天时达到峰值,7天至14天趋化至CNV部位的BMCs数量直线下降,14天后降至对照组水平。对照组在相应的时间点趋化至CNV部位的BMCs数量较少且变化较慢,且3天后增长速度下降,7天后趋化至CNV部位的BMCs数量即开始下降,到第14天降至最低水平。14天后实验组和对照组小鼠眼部发光量无明显差别,平行且稳定变化,28天后,两组小鼠眼部发光量均趋于稳定。老年鼠骨髓移植给成年鼠的实验组小鼠无论是CNV厚度,还是CNV直径都与成年鼠骨髓移植给成年鼠的对照组小鼠有明显的统计学差异(P<0.05)。
　　结论:利用BLI技术可以分析对比不同干细胞参与CNV的能力及其与CNV的相互影响。这种在活体内实时、敏感的观察各类干细胞生理病理活动的技术将为研究CNV发生机制提供了一种新的客观的辅助方法。

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第一部分 在体生物发光成像术观察骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的形成

0 引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 在体生物发光成像术观察高龄骨髓来源细胞对脉络膜新生血管形成的影响

0 引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢