人心脏干细胞定向分化为心肌细胞的研究

摘要

研究背景
　　心肌梗死(MI)是引起缺血性心肌病(ICM)导致心力衰竭(HF)的主要病因之一。目前临床上的治疗主要包括药物、介入、外科手术治疗。药物治疗可以改善症状并降低冠心病风险;早期介入治疗可以开通闭塞血管降低心肌梗死的死亡率;外科冠脉搭桥治疗可以改善闭塞血管远端心肌细胞的血液供应,改善症状。心脏移植治疗可从根本上达到治疗的目的,但存在免疫排除反应、供体数量有限,费用昂贵等问题。然而对于心肌缺血梗死后细胞丧失的问题,目前常用的临床治疗方法均无法解决,不能达到心脏细胞水平重建的要求。心脏干细胞(CardiacStemCells,CSCs)具有自我复制、克隆形成、多向分化潜能,具有定向分化为心脏细胞系趋势,而自体心脏干细胞移植治疗不存在伦理问题、无免疫排斥反应,是治疗心肌梗死及缺血性心肌病理想的种子细胞。目前国内外关于心脏干细胞向心肌细胞诱导分化的研究较多,但大多数为动物实验,且由于实验方法不同诱导分化的效率也颇有差异。人心脏干细胞因其独特的性能,具有更广泛的临床应用潜能,有望成为一种优质高效治疗心血管疾病的种子细胞。
　　研究目的
　　1.研究人心脏干细胞体外分离、培养及生物学特征。
　　2.探索人心脏干细胞的纯化与鉴定方法。
　　3.探索5-AZA和AngII及联合诱导人心脏干细胞向心肌细胞分化及提高分化率的方法。
　　研究方法
　　1.经患者或家属同意并签署知情同意书后从心外科手术中获取人心脏右心耳组织,经Ⅱ型胶原酶消化、接种培养,待其融合达90％左右后进行传代,选P2~P4细胞用流式细胞仪对其进行表面标志物CD117(c-kit)、CD31、CD45检测。
　　2.P2~P8细胞与免疫荧光(PE)标记的心脏干细胞抗体CD117(c-kit)结合后经流式细胞仪无菌分选纯化心脏干细胞,对无菌分选纯化后的c-kit+CSCs进行培养、细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定。
　　3.选取无菌分选纯化后细胞融合90%左右的c-kit+CSCs进行诱导、分化实验。实验随机分为4组:①空白对照组(Control组普通细胞培养液)、②5-AZA诱导组(10μmol/L)、③AngII诱导组(0.1μmol/L)、④5-AZA和AngII联合诱导组(10μmol/L+0.1μmol/L)。空白对照组更换普通细胞培养液培养;5-AZA、AngII单独诱导组诱导24h后弃去诱导培养液,PBS洗涤2次,更换普通细胞培养液培养;5-AZA和AngII联合诱导组24h后弃去5-AZA诱导培养液,PBS洗涤2次,更换AngII诱导培养液,24h后PBS洗涤2次,更换普细胞培养液继续培养。分别在96h、4W观察细胞形态变化;4W后用免疫荧光染色、WesternBlotting测定心肌细胞特异性蛋白cTnI、Cx43的表达;用流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率。
　　研究结果
　　1.原代细胞形态学特征:倒置相差显微镜下观察,细胞10d左右贴壁,贴壁细胞大小不一,呈三角形、梭形、多角形。贴壁1W后细胞快速增殖,向四周呈集落样生长,20d左右融合达到80%。
　　2.细胞表面标志物流式细胞仪检测:用流式细胞仪对细胞表面CD117、CD31、CD45标志物检测,统计结果显示:CD117阳性表达率为(26.4±7.52)%、CD31阳性表达率为(8.5±3.81)%、CD45阳性表达率为(1.85±0.51)%。
　　3.人心脏干细胞纯化及免疫荧光染色鉴定:流式细胞仪无菌分选获得纯度约为98.5%的c-kit+CSCs。倒置相差显微镜下观察纯化的c-kit+CSCs,细胞24h内均匀贴壁,细胞体积较原代细胞小,形态相似,呈长梭形或短梭形,折光性强,经7d左右停滞期后细胞快速扩增,14d左右融合达80%。免疫荧光显微镜下观察几乎所有细胞有都表达红色荧光(PE-CD117),细胞呈长梭形或短梭形,细胞核圆、居中。
　　4.人心脏干细胞诱导后细胞形态学特征:诱导96h后,Control组细胞形态没有明显改变,排列无规律性;5-AZA组细胞死亡脱落明显,细胞近似梭形,以簇状排列为主;AngII组细胞近似梭形,以条梭状排列为主;AngII和5-AZA联合组细胞少量死亡脱落,细胞近似梭形,排列呈以簇状或条索状。4W后Control组:细胞体积大小不均一,呈长梭状或短梭状、多角形等,少数细胞形态较诱导前变长,无明显排列规律;各诱导组细胞形态均变长,以梭形细胞为主,排列呈束状,5-AZA和AngII联合组细胞形态、排列变化最为显著。
　　5.人心脏干细胞诱导后心肌细胞特异性蛋白cTnI、Cx43测定:诱导4W后免疫荧光、Westernblotting结果显示,四组细胞中均有cTnI、Cx43表达,Control组表达最弱,5-AZA和AngII联合组表达最强。统计结果显示:5-AZA组、5-AZA和AngII联合组表达高于Control组,有显著统计学差异(P<0.01);5-AZA和AngII联合组表达高于AngII组,有显著统计学差异(P<0.01);5-AZA和AngII联合组表达高于5-AZA组,有统计学差异(P<0.05);5-AZA组表达高于AngII组,有计学差异(P<0.05);AngII组高于Control组,有统计学差异(P<0.05)。
　　6.人心脏干细胞诱导后心肌细胞分化率测定:诱导4W后流式细胞仪分析各组心肌细胞分化率,统计结果显示:Control组(28.86±4.62)%、5-AZA组(53.71±7.5)%、AngII组(41.48±7.12)%、5-AZA和AngII联合组(65.74±6.21)%;四组间见均有统计学差异(P<0.05);5-AZA组、5-AZA和AngII联合组高于Control组,有显著统计学差异(P<0.01)。
　　研究结论
　　1.采用酶消化法可以从人右心耳组织中分离培养出人心脏干细胞。
　　2.通过流式细胞仪无菌分选纯化获得高纯度的c-kit+CSCs,人c-kit+CSCs在心脏干细胞培养液中可以快速生长增殖。
　　3.人c-kit+CSCs能够在普通细胞培养液中向心肌细胞分化,具有自我分化可能性,但速度较慢。
　　4.5-AZA、AngII均能诱导人c-kit+CSCs向心肌细胞分化,5-AZA和AngII联合诱导的心肌细胞分化率高于5-AZA、AngII单纯诱导方案,分化率可达(65.74±6.21)%。

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实验一 人心脏干细胞体外分离、培养及生物学特征

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二 人心脏干细胞纯化及鉴定

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验三 5-AZA和Ang II及联合诱导人心脏干细胞向心肌细胞分化的研究

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢