Shugoshin1在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药中的作用及机制研究

摘要

肺癌是目前全世界死亡率最高的恶性肿瘤。绝大多数患者就诊时已为晚期,丧失手术机会。化疗是这类患者的主要治疗手段,其中紫杉类药物是目前非小细胞肺癌化疗中最常用且有显著疗效的新一代药物,但在治疗过程中肿瘤细胞对其产生耐药性是化疗失败的主要原因。因此,如何克服非小细胞肺癌对紫杉类药物的耐药是肺癌治疗过程中亟需解决的重要问题。目前对紫杉类药物耐药机制的研究包括P-gp蛋白,MRP蛋白的高表达,微管β亚基及α亚基的突变,凋亡基因的改变及细胞DNA修复系统的加强等等。但上述机制仍不能圆满解释肿瘤的MDR现象。SGO1是我们前期研究中利用CellomicsArrayScan平台筛选出的一个肺癌相关新分子。在前期的研究发现:SGO1(shugoshin-1)可能是导致非小细胞肺癌发生的关键分子,研究中还发现SGO1主要影响细胞分裂G2/M期,而紫杉类药物正是通过阻滞肿瘤细胞停留在G2/M期来发挥细胞毒性作用,但其与紫衫类药物耐药的关系还尚未有任何研究报道。进而我们用化疗药物多西紫杉醇通过瞬时反复作用的方法筛选出多西紫杉醇耐药的细胞株A549/Taxotere并检测SGO1的表达,进一步通过构建SGO1表达上调和下调的非小细胞肺癌细胞亚系,研究SGO1在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药中的作用,为SGO1逆转多西紫杉醇耐药提供证据。
　　目的:
　　1.培养对多西紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞A549/Taxotere,检测其SGO1的表达。2.构建SGO1表达上调和下调的非小细胞肺癌细胞亚系,研究SGO1在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药中的作用。
　　3.进一步研究SGO1影响非小细胞肺癌多西紫杉醇的耐药机制。
　　方法:
　　1.通过RT-PCR,Westernblot检测A549/Taxotere中SGO1的表达。
　　2.通过构建SGO1的si-RNA质粒和正义表达质粒经慢病毒包装分别转染A549/Taxotere及亲本A549细胞,分别命名为siSGO1-LV-A549/Taxotere和SGO1-LV-A549利用Western-blot及RT-qPCR鉴定其干预效果。
　　3.利用MTT比色法观察外源性改变SGO1的表达后,SGO1-LV-A549及siSGO1-LV-A549/Taxotere对多西紫杉醇药物敏感性的影响。
　　4.通过AnnexinV/PI染色法检测SGO1上调及下调的非小细胞肺癌细胞系中多西紫杉醇诱导细胞凋亡的变化,并计算凋亡指数。
　　5.借助流式细胞仪检测SGO1上调及下调的非小细胞肺癌细胞系中多西紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞周期的变化。
　　6.利用RT-qPCR和Westernblot方法检测转染SGO1正义表达细胞株和小干扰RNA载体细胞株中P-gp,Bcl-2,Bax的表达差异。
　　结果:
　　1.SGO1在多西紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞株A549/Taxotere中mRNA及蛋白表达水平明显增高。
　　2.与对照细胞相比,转染正义SGO1表达载体的非小细胞肺癌细胞对多西紫杉醇敏感性明显降低;加药后,G2/M期细胞比例明显增减;多西紫杉醇诱导的细胞凋亡指数明显减少,转染细胞内的Bcl-2表达显著增强,Bax的表达显著减弱;细胞内P-gp表达增加(P<0.05)。
　　3.与对照细胞相比,转染SGO1siRNA的非小细胞肺癌细胞能明显逆转对多西紫杉醇的抵抗;加药后,G2/M期细胞相应增加;多西紫杉醇诱导的细胞凋亡指数明显增加,转染细胞内的Bcl-2表达减弱,Bax的表达明显增强,细胞内P-gp表达降低(P<0.05)。
　　结论:
　　1.SGO1高表达与非小细胞肺癌细胞对多西紫杉醇的耐药密切相关。
　　2.成功建立SGO1上调非小细胞肺癌细胞株,其通过抑制促凋亡分子Bax的表达,增强抑制凋亡分子Bcl-2的表达来降低化疗药物诱导的细胞凋亡,通过减少G2/M期阻滞,增加P-gp蛋白表达这些途径降低细胞对多西紫杉醇的敏感性。
　　3.成功建立SGO1下调非小细胞肺癌细胞株,其通过上调促凋亡分子Bax的表达,下调抑制凋亡分子Bcl-2的表达来增加化疗药物诱导的细胞凋亡,通过增加细胞G2/M期阻滞,下调P-gp蛋白表达这些途径增加细胞对多西紫杉醇的敏感性。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

文献回顾

1.1β微管是紫杉醇类及其它抗有丝分裂药物的细胞靶点。

1.2 紫杉醇类药物的药理学机制

1.3 紫杉醇类药物产生的细胞学反应

第一部分 SGO1 参与非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药的表型研究

1 材料

1.1 细胞株

1.2 抗体和引物

1.3 其他主要试剂：

1.4 主要仪器：

2 方法

2.1 细胞培养和样品制备

2.2 Western Blot 检测目的蛋白在多西紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞株中的表达

2.3 细胞 cDNA 样品制备

2.4 PCR

3 结果

4 讨论

第二部分 SGO1 参与非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

个人简历：

在读期间发表论文情况

致谢

致谢