X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)影响肿瘤细胞增殖的生物学新功能研究

摘要

【背景】
　　众所周知,XIAP通过抑制 caspase活性参与调节细胞凋亡[1]。在多种恶性肿瘤组织中,XIAP表达上调,包括前列腺癌[2],急性和慢性白血病[3,4],及其他恶性肿瘤[5-7]。XIAP的表达程度与肿瘤的侵袭和转移能力有关[8,9]。已发现XIAP与一些肿瘤的发生如吸烟诱导的肺癌等的相关性[10]。除了参与细胞凋亡调节外,它也有其他非细胞凋亡的生物学功能,如参与信号转导,参与铜代谢,参与泛素化等[11]。在凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员中,XIAP是最有潜力的肿瘤治疗靶标。研究证实,使用化学抑制剂或小干涉RNA(siRNA)抑制XIAP表达能够抑制肿瘤细胞增殖[12,13],但已有研究并没有阐明XIAP是直接抑制肿瘤细胞增殖,或是通过其他间接效应抑制肿瘤细胞增殖。
　　我们最近的研究证实XIAP敲除或低表达能够降低HCT116细胞迁移及侵袭,而恢复XIAP表达能够逆转这种改变[18],首次证实XIAP具有调节恶性肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。我们进一步的研究证实XIAP能够与RhoGDIα结合,抑制RhoGDIα在第138位组氨酸的SUMO化影响蛋白的稳定,进而影响小Rho GTP酶活性,肿瘤细胞β-actin多聚化、细胞骨架重排和细胞迁移[18,19]。因此,发现和鉴定XIAP非细胞凋亡的生物学功能具有十分重要的生物学意义。
　　【目的】
　　本课题拟在实验室前期研究的基础上,旨在对XIAP调节肿瘤细胞增殖的分子机制进行研究。
　　【方法】
　　(1)利用脂质体转染法将 HA-XIAP、HA-XIAP?RING、HA-XIAP?BIR、HA-XIAP H467A及pcDNA3.0空质粒转染入HCT116 XIAP-/-细胞,经过抗生素筛选构建稳定转染细胞株;(2)利用软琼脂克隆形成实验检测不同稳定转染细胞株的克隆形成能力;(3)利用ATP酶活性检测实验检测不同稳定转染细胞株的细胞增殖速度;(4)利用PI染色的流式细胞检测测定细胞周期分布;(5)利用western blot实验检测细胞周期调节蛋白表达;(6)利用RT-PCR实验检测NFAT基因的转录;(7)通过 NFAT报告基因转染后检测荧光素酶活性;(8)通过脂质体转染 Akt激酶的显负性突变体DN-Akt质粒并建立稳定转染细胞株,观察抑制Akt活性对细胞克隆形成能力的影响;(9)通过脂质体转染cyclin E特异的shRNA质粒减低cyclin E表达;(10)通过软琼脂克隆形成实验检测抑制cyclin E表达对细胞克隆形成能力的影响;(11)利用向细胞内转染E2F1突变的cyclin E启动子报告基因质粒并检测荧光素酶活性检测E2F1转录因子在XIAP调控cyclin E转录中的作用;(12)利用免疫共沉淀实验检测XIAP BIR结构域与E2F1蛋白的结合能力;(13)通过分离提取细胞核蛋白/胞浆蛋白检测转录因子转位;(14)通过脂质体转染c-Jun显负性突变体TAM67检测其对XIAP介导的cyclin D1转录的影响;(15)利用免疫共沉淀检测c-Jun和PP2A蛋白在细胞内的结合。
　　【结果】
　　1.XIAP不同结构域和E3连接酶活性分别调节肿瘤细胞增殖
　　(1)软琼脂克隆形成实验结果显示,XIAP-/-(vector)细胞形成克隆的数量较WT(vector)细胞明显减少;向XIAP-/-细胞中转染HA-XIAP后,克隆形成数量明显增加。但是向 XIAP-/-细胞中转染 HA-△BIR和 HA-XIAP H467A表达质粒后,与XIAP-/-(vector)细胞相比克隆形成数量没有明显改变,XIAP-/-(HA-△RING)细胞克隆形成数量和大小明显增加。(2)ATP酶活性检测细胞增殖能力,结果与软琼脂内克隆形成实验趋势一致。这一结果说明,XIAP调节肿瘤细胞克隆形成能力是通过影响细胞增殖速率发挥作用的。
　　2.XIAP的BIR结构域影响NFAT1转录因子的蛋白稳定性及其生物学功能
　　(1)Western Blot显示在XIAP-/-(vector)、XIAP-/-(HA-△BIR)细胞内Akt激酶第308和473位的磷酸化水平高于其他细胞。(2)转染Akt激酶的显性负性突变质粒(Dominant negative mutant Akt, DN-Akt)抑制 Akt磷酸化发现 XIAP-/-(HA-△BIR)细胞在软琼脂内的克隆形成恢复正常。(3)Western blot结果显示在XIAP-/-(vector)和XIAP-/-(HA-?BIR)细胞中NFAT1蛋白表达低于正常,荧光素酶报告基因检测显示 NFAT依赖的转录活性低于 XIAP-/-(HA-XIAP)细胞。(4)在XIAP-/-(vector)和XIAP-/-(HA-?BIR)细胞中NFAT1蛋白的降解速度比WT细胞中快。(5)XIAP BIR结构域缺乏时MDM2的磷酸化增加,XIAP BIR结构域调节MDM2的磷酸化与Akt磷酸化增高有关。以上结果显示,XIAP介导的细胞凋亡信号通路和Akt介导的细胞生存信号通路之间存在相互影响。
　　3.XIAP RING结构域缺失影响cyclin E基因转录及其生物学功能
　　(1)流式细胞检测显示 XIAP RING结构域缺失影响肿瘤细胞 G1/S期过渡, G0/G1期比例明显减少。(2)Western blot结果显示,XIAP RING结构域缺失的细胞内cyclin E表达增高。(3)RT-PCR和启动子报告基因分析显示cyclin E表达发生在转录水平。(4)使用cyclin E特异的shRNA转染XIAP-/-(HA-△RING)细胞,抑制了细胞异常增殖的能力。(5)启动子报告基因分析显示,XIAP RING结构域缺失影响cyclin E表达与E2F1转录因子转录活性增强有关。(6)免疫共沉淀显示,XIAP通过BIR结构域与E2F1结合。(7)蛋白亚定位分析显示,XIAP的RING结构域影响XIAP蛋白的细胞内亚定位。以上结果显示,XIAP能够通过BIR结构域与E2F1结合增强其对下游基因的转录活性,当RING结构域缺失的情况下,XIAP在核内异常表达,影响了肿瘤细胞的增殖能力。
　　4.XIAP通过其RING结构域的E3连接酶活性调节cyclin D1基因转录及其生物学功能
　　(1)XIAP-/-(vector)细胞处于G0/G1期的比例较WT(vector)细胞明显增加,达到84.58％;转染了HA-XIAP的XIAP-/-细胞处于G0/G1期的比例为69.31%,与WT(vector)细胞(71.51%)相比无明显区别;转染了HA-XIAP H467A的XIAP-/-细胞处于G0/G1期的比例为78.94%,与XIAP-/-(vector)细胞接近。(2)Western blot结果显示,XIAP E3连接酶活性能够影响cyclin D1蛋白表达,对其他细胞周期调节蛋白的表达没有影响。(3)RT-PCR和启动子基因报告检测证实XIAP的E3连接酶活性影响cyclin D1转录。转录因子转位分析结果显示,c-Jun磷酸化和AP-1转录因子可能参与了XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1转录。(4)荧光素酶报告基因分析结果显示,XIAP的E3连接酶活性可以影响AP-1转录活性。(5)c-Jun的显性负性突变体TAM67能够改变XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1表达。(6)免疫共沉淀证实PP2A能够与c-Jun在细胞内结合。(7)抑制PP2A活性能够使c-Jun磷酸化和cyclin D1表达增高。以上结果提示,XIAP的E3连接酶活性通过PP2A/c-Jun/cyclin D1通路影响肿瘤细胞G1/S期过渡和细胞增殖。以上结果提示, XIAP的E3连接酶活性通过PP2A/c-Jun/cyclin D1通路影响肿瘤细胞G1/S期过渡和细胞增殖。
　　【结论】
　　XIAP蛋白除了调节细胞凋亡,还可以调节细胞增殖,而且其分子结构中的RING结构域、BIR结构域及E3连接酶活性在调节肿瘤细胞生长过程中发挥了不同的作用。XIAP的E3连接酶活性影响肿瘤细胞增殖能力与调节cyclin D1表达有关;XIAP的E3连接酶活性能够抑制PP2A磷酸化,进而影响PP2A对c-Jun磷酸化的调节,从而调节cyclin D1的转录。XIAP的RING结构域缺引起肿瘤细胞中cyclin E高表达,其中BIR结构域能够与E2F1结合促进其转录活性,进而影响cyclin E转录和肿瘤细胞增殖。XIAP的BIR结构域缺失引起肿瘤细胞中Akt磷酸化活性增强,进而影响MDM2磷酸化,NFAT1蛋白稳定性和肿瘤细胞增殖能力。以上结果提示,E3连接酶活性是肿瘤治疗的潜在靶标;以XIAP为靶标的肿瘤治疗需要考虑不同结构域的不同生物学功能;XIAP和Akt介导的细胞增殖调节通路之间存在复杂的调节联系,需要进一步研究其精确的分子调控机制。

目录

封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文 献 回 顾

1．引言

2．XIAP的结构特点及生物学功能

3．XIAP抗凋亡的作用机制

4．XIAP与肿瘤治疗的关系

5．XIAP蛋白与环境医学的关系

6．XIAP蛋白新生物学功能的研究进展

实 验 内 容

实验一 XIAP BIR和RING结构域在调节肿瘤细胞增殖中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 XIAP BIR结构域影响NFAT转录因子的蛋白稳定性及其生物学功能

1 材料

2 方法

3 结果

实验三 XIAP RING结构域缺失影响cyclin E基因转录及其生物学功能

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 XIAP通过其RING结构域的E3连接酶活性调节cyclin D1基因转录及其生物学功能

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢