电针增加Neurogenin2表达和促进神经发生从而改善全脑缺血后小鼠神经行为学的研究

摘要

背景
　　随着医疗条件的进步,脑中风的存活率已经有了很大的提高,但是脑中风的后遗症仍然是亟需攻克的难题。目前认为中风后神经系统障碍的主要原因,是没有足够的新生神经元来替代凋亡的神经细胞,并且发挥功能。现在的研究揭示在成年哺乳动物中枢神经系统的侧脑室外侧壁室下带(SVZ)和海马齿状回(DG)的颗粒下层储存有神经干细胞,可以在一定的条件下增殖分化成神经元和胶质细胞,参与神经功能的修复过程,称之为神经发生。
　　针灸在治疗中风后遗症方面有显著的疗效和悠远的历史,电针(electroacupuncture,EA)是融合针灸理论和生物学电刺激的产物,能产生和针刺相同的效应,无痛且安全可靠,临床上已经广泛用于中风后的治疗,但是具体机制仍有待发掘研究。
　　Neurogenin2(Neurog2)是调节胚胎期大脑皮质神经发生和神经元放射状迁移的关键的转录因子。它在神经系统不同区域参与了神经元的分化与亚型的决定。Neurog2在成年哺乳动物脑缺血后的表达的研究报道很少,亦不清楚。
　　本实验构建了动物的全脑缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)模型,观察早期给予电针治疗能否改善缺血后的运动和认知功能障碍,并探讨了可能的机制,同时观察了缺血后Neurog2表达动态变化,探索电针治疗改善缺血后的运动和认知功能障碍是否与增加Neurog2和促进神经发生相关,并为电针治疗中风以及利用Neurog2蛋白治疗脑中风提供相关实验证据。
　　实验一电针能有效改善脑缺血后小鼠的运动和认知功能
　　目的
　　探讨电针在成年动物脑缺血后的治疗的有效性。
　　方法
　　5月龄的C57雄性小鼠,体重超过20g,根据SPSS统计软件产生随机数字将其随机化分成四组:假手术组(sham组n=6),假手术组+电针治疗组(EA+sham组n=6),全脑缺血组(I/R组n=6),电针+全脑缺血组(EA+I/R组n=6),采用双侧颈总动脉结扎20min再恢复血液灌流的方法构建全脑缺血模型,给予EA治疗的两组则在构建模型成功后连续5d,每天给予电针刺激百会穴,其参数基于本实验室前期实验成果:时长30min、频率15/2Hz、强度1-2mA。电针治疗结束后,进行神经行为学评分以及水迷宫测试。
　　结果
　　1)运动功能评分:与sham组相比,EA+sham组的神经行为学评分较优于对照组,但没有统计学差异,而缺血两组相比,EA+I/R组的评分优于I/R组,差异具有统计学差异。缺血两组的运动功能明显的较对照两组的差。2)水迷宫测试:定向航行试验,与I/R组相比较,EA+I/R组小鼠的逃避潜伏期明显缩短,同时EA+sham组小鼠的逃避潜伏期较sham组为短,但没有统计学差异。空间探索实验结果显示,在实验的第6天,EA+I/R组小鼠与I/R组相比其在平台所在象限游动的时间明显较长(*P<0.05),EA+sham组小鼠的目标象限时间与sham组相比也较长。
　　结论
　　电针能够有效的改善全脑缺血后小鼠的运动和认知功能,对于全脑缺血后的症状有较好的治疗作用。
　　实验二电针抑制全脑缺血后小鼠神经元凋亡和促进神经发生
　　目的
　　探讨电针改善全脑缺血后小鼠的运动和认知功能是否与通过抑制神经元凋亡和促进神经发生有关。
　　方法
　　5月龄成年C57雄性小鼠,采用结扎双侧颈总动脉构建全脑缺血模型,随机分成四组sham组(n=9),EA+sham组(n=9),I/R(n=9),EA+I/R组(n=9)。EA+sham组和EA+I/R组则在构建模型成功后第二天开始每天给予电针刺激百会穴,其参数:时长30min、频率15/2Hz、强度1-2mA。于建模后第二天四组动物腹腔注射Brdu,连续14d,剂量50mg/kg。于注射Brdu结束后灌注切脑片进行神经元凋亡TUNEL检测,尼氏染色和免疫荧光染色。
　　结果
　　1)神经发生的结果相较于sham组,缺血两组的Brdu阳性细胞数目的表达增加,电针治疗后神经发生的数目更加明显,并且与Neurog2有共定位。2)TUNEL阳性细胞计数发现EA+I/R组的TUNEL阳性细胞计数少于单纯缺血组,说明电针具有抑制神经元凋亡的作用,而两个sham组并未检测到凋亡的神经元。3)尼氏染色结果提示,缺血两组小鼠海马内神经元排列紊乱,细胞内尼氏小体消失,但是给予电针处理的缺血组的神经元损害程度相对减轻。
　　结论:电针刺激改善了脑缺血小鼠的神经行为学发挥脑保护作用很可能是通过抑制神经元凋亡和促进神经发生这两点实现的。
　　实验三电针促进脑缺血后小鼠脑内Neurog2表达研究
　　目的
　　探讨脑缺血后成年小鼠脑内Neurog2的表达变化以及电针能否激活神经前体基因Neurog2的表达。
　　方法
　　5月龄的C57雄性小鼠,体重超过20g,根据SPSS统计软件产生随机数字将其随机化分为四组,sham组(n=9),EA+sham组(n=9),I/R组(n=15),EA+I/R组(n=9),采用双侧颈总动脉结扎20min再恢复血液灌流的方法构建全脑缺血模型。I/R组分别在3d、5d、7d各时刻分别处死三只实验小鼠。EA+I/R组和EA+sham组则在构建模型成功后连续5d,每天给予电针刺激百会穴,其参数基于本实验室前期实验成果:时长30min、频率15/2Hz、强度1-2mA。电针治疗结束后,实行颈椎脱臼法处死小鼠。立刻置冰上取材,完整剥离小鼠双侧的海马组织,提取RNA做PCR实验分析,并灌注取脑进行免疫荧光检测。
　　结果
　　1)Neurog2在成年小鼠全脑缺血再灌注损伤后的表达情况:从检测到Neurog2的mRNA水平看来,与假手术组相比,缺血后3dNeurog2的表达逐渐增加,5d时达到峰值(P<0.01),7d开始回落。2)电针治疗后Neurog2的表达变化:当给予Sham组加电针治疗后,相比单纯Sham组Neurog2的水平明显增加(P<0.01),缺血加电针治疗组的mRNA水平也明显较缺血组增加(P<0.001),而两个电针组相比较则缺血加电针组Neurog2的表达也是高于单纯电针组。3)免疫荧光染色可以看到脑缺血后Neurog2表达增加,并且在电针刺激后表达明显增强。
　　结论:Neurog2在成年动物脑缺血再灌注后的表达会被激活呈现一个动态的变化,并且电针可以促进Neurog2的表达增加。
　　实验四Neurog2脑内注射改善神经行为学以及促进神经发生的研究
　　目的
　　研究侧脑室注射Neurog2蛋白对脑缺血小鼠神经功能及海马区神经发生的影响,探讨侧脑室注射Neurog2蛋白的作用。
　　方法
　　将18只C57小鼠随机分为3组:假手术组(sham组)和全脑缺血模型组(I/R组),缺血组加注射Neurog2蛋白组(Neurog2+I/R组),每组6只。第三组于建立模型前1天,单次给予侧脑室注射Neurog2蛋白(10umol/L)4ul。注射完毕后第二天构建全脑缺血模型,假手术组给予类似操作但不结扎颈总动脉,建模后每组小鼠每天连续注射腹腔注射Brdu7天,观察给予注射Neurog2后各组小鼠的神经行为学和海马的神经发生的情况。
　　结果
　　1)TMS评分:相较于sham组,两个缺血组动物的神经功能评分都有所下降,给予Neurog2蛋白注射小组的小鼠的神经行为学评分优于缺血组。2)免疫荧光:组织学的结果显示给予注射Neurog2小组小鼠的脑内的Brdu阳性细胞的数目明显较缺血组和sham组有所增加。
　　结论
　　脑内注射Neurog2可以改善缺血后小鼠的运动行为学评分,并且可以促进神经发生。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 脑中风的相关研究进展

2 脑缺血后的神经发生及其调节

3 针刺治疗缺血性脑中风对神经干细胞增殖分化的影响研究

4 神经前体基因 Neurogenin 家族的研究进展

正文

实验一 电针改善脑缺血后小鼠神经行为学的基础研究

1 材料

2 方法

3. 结果

4 讨论

实验二 电针抑制全脑缺血后小鼠神经元凋亡和促进神经发生

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三电针促进神经前体基因 Neurog2 的表达

1 材料

2 方法

3 PCR 结果

4. 讨论

实验四 Neurog2 改善脑缺血小鼠的神经行为学以及促进神经发生

1 材料

2 方法

3 .结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢