硫化氢在葡萄应答低温胁迫中的作用机制

摘要

低温是限制葡萄（Vitis vinifera L）生产的主要影响因子，葡萄抵御低温的作用机制一直引起人们的关注。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是一种普遍存在且参与植物生长发育和抵御逆境胁迫的物质，但鲜见其在植物抗冷过程中的作用报道，尚未解析H2S在葡萄抵御低温胁迫中的作用机制。 本论文以抗冷葡萄品种‘F-242’与冷敏感品种‘赤霞珠’为材料，结合药理学实验，检测低温对H2S含量以及H2S合成酶L/D-半胱氨酸脱巯基酶（L/D-cysteine desulfhydrase，L/D-CDes）的影响，以期证明H2S是葡萄抵御低温胁迫过程中的重要物质;以抗冷葡萄品种和L/D-CDes缺失突变体为材料，综合运用植物生理学、生物信息学和分子生物学等现代生物学技术手段，证明来自L/D-CDes途径的H2S参与对低温胁迫的应答;以抗冷葡萄品种‘F-242’为材料，探究在葡萄应答低温过程中H2S与低温相关信号分子一氧化氮(nitric oxide，NO)、低温应答相关基因ICE1和CBF3的相互关系，提出葡萄中存在“低温→→VvL/D-CDes→→H2S→→VvICE1/VvCBF3→→抗冷”的时空调控模式，以期探讨H2S在葡萄抵御低温胁迫过程中作用的生理和分子机制。该研究将为探明H2S介导的葡萄抵御低温信号转导中的作用机制提供实验证据，具有重要理论意义和潜在的应用价值。 结果表明，低温处理能够提高抗性葡萄品种与冷敏感葡萄品种叶片中H2S含量、L/D-CDes活性和VvL/D-CDes的表达量，且抗性葡萄中H2S含量明显高于冷敏感性葡萄;外施H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)能够显著降低低温对抗性葡萄的伤害;H2S合成酶抑制剂亦能够明显降低低温处理后抗性葡萄中H2S含量。同时低温下拟南芥L/D-CDes缺失突变体丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及细胞膜相对透性增加，植株受低温胁迫程度显著高于野生型。综合以上实验证明来自L/D-CDes途径的H2S参与植物抵御低温胁迫过程。 为探究H2S在葡萄抵御低温胁迫中的作用机制，以抗冷葡萄品种‘F-242’为材料，观测了外源H2S对葡萄保护酶活性、超氧阴离子自由基(production rate of superoxideradicals，O2·-)产生速率、MDA含量和细胞膜透性的影响。结果显示，外施H2S供体NaHS显著提高‘F-242’叶片保护酶活性，降低‘F-242’叶片活性氧含量、MDA含量以及细胞膜相对透性;而施加H2S清除剂HT作用相反，这表明H2S能够通过调节保护酶活性，调控活性氧水平，进而保护细胞膜功能，提高植物抗冷能力。 克隆冷诱导关键转录因子VvICE1和VvCBF3，并对其进行生物信息学分析，利用PCR技术检测了低温胁迫条件下H2S对其表达的影响，以期探明H2S作用的分子机制。结果显示，低温明显诱导VvICE1和VvCBF3表达，NaHS可以显著提高VvICE1和VvCBF3在低温下表达量，HT具有相反的作用效应。由此推测VvICE1和VvCBF3参与了H2S葡萄抵御低温胁迫过程。 葡萄抵御低温胁迫的过程由一系列信号分子组成，低温处理后葡萄叶片中H2S和NO分别在5h和3h后猝发，那么在葡萄应答低温过程中H2S是否与NO有相互作用关系？结果发现，H2S清除剂亚牛磺酸（hypotaurine，HT）不能影响低温下NO水平的变化，而NO清除剂2-4，4，5，5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt，cPTIO）可以明显降低低温下H2S含量。由此推测，NO位于H2S上游参与葡萄应答低温过程。 综合以上实验结果，本论文首次证明来自L-D-CDes途径的H2S参与葡萄应答低温的信号转导过程;H2S能够通过调控葡萄体内活性氧代谢、提高VvICE1与VvCBF3表达量进而提高葡萄抗冷性，同时NO可能位于H2S上游参与葡萄抗冷过程。首次提出葡萄中存在“低温→→VvL/D-CDes→→H2S→→ VvICE1/VvCBF3/保护酶→→抗冷”的时空调控模式。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 植物材料

1．2 实验中所用的相关引物

1．3 实验中所用的菌株、试剂和仪器

2．实验方法

2．1 材料培养

2．2 溶液配制

2．3 培养基配制

2．4 生理指标测定方法

2．5 分子克隆相关方法

2．6 半定量PCR测定基因表达量

2．7 数据统计和分析

结果与分析

1．H2S参与葡萄应答低温胁迫过程

2．L-／D-CDes途径的H2S参与植物抵御低温胁迫过程

2．1 低温胁迫对葡萄叶片L／D-CDes活性的影响

2．2 H2S合成酶抑制剂对低温胁迫下葡萄H2S含量的影响

2．3 低温胁迫对葡萄叶片L-／D-CDes表达量的影响

2．4 低温对L／D-CDes缺失突变体抗寒性的影响

3．VvL／D-CDes的克隆和表达特性分析

3．1 VvL／D-CDes的克隆和生物信息学分析

3．2 VvL／D-CDes的组织表达特异性分析

4．H2S在葡萄抵御低温胁迫中的生理生化机制

4．1 H2S对低温胁迫下葡萄叶片O2.-产生速率的影响

4．2 H2S对低温胁迫下葡萄叶片SOD活性的影响

4．3 H2S对低温胁迫下葡萄叶片MDA含量的影响

4．4 H2S对低温胁迫下葡萄叶片细胞膜相对透性的影响

5．VvICE1和VvCBF3介导H2S参与葡萄抵御低温胁迫过程

5．1 VvICE1和VvCBF3的克隆及生物信息学分析

5．2 HT与NaHS对低温下葡萄叶片VvICE1和VvCBF3表达量的影响

6 葡萄应答低温信号转导链中NO和H2S的相互关系

6．1 葡萄应答低温胁迫过程中H2S清除剂对NO含量的影响

6．2 葡萄应答低温过程中NO清除剂对H2S含量的影响

讨论

结论

展望

参考文献

缩略词对照表

致谢