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摘要
第一章 文献综述
1 小反刍兽疫的国内外研究现状及发展动态分析
1.1 小反刍兽疫病简介
1.2 小反刍兽疫病毒国内外诊断技术研究现状
1.3 小反刍兽疫防控发展动态分析
2 转基因植物疫苗的研究现状
2.1 转基因植物疫苗概况
2.2 转基因植物疫苗应用实例
2.3 转基因植物疫苗的利弊
2.4 转基因植物疫苗的前景展望
3 苜蓿遗传转化方法研究进展
3.1 农杆菌介导法
3.2 基因枪法
3.3 花粉管通道法
4 苜蓿遗传转化高效受体的选择
5 苜蓿基因工程的前景和局限性
6 目的意义
第二章 小反刍兽疫病毒F基因及表达载体相关序列克隆
1 试验材料
1.1 菌株、DNA和质粒
1.2 载体
1.3 酶与化学试剂
1.4 仪器耗材
2 试验方法
2.1 目的基因的PCR扩增
2.2 各基因和DNA片段TA克隆
2.3 重组质粒的鉴定
3 结果与分析
3.1 目的基因片段PCR扩增结果
3.2 重组质粒酶切鉴定
4 小结
第三章 植物表达载体的构建
1 试验材料
1.1 菌株与载体
1.2 酶和试剂
1.3 仪器耗材
2 试验方法
2.1 植物表达载体pBI121-F的构建
2.2 强启动子CsVMV替换pBI121原启动子CaMV35,构建表达载体pBI121-CsVMV
2.3 插入荧光标记基因GFP构建表达载体pBI121-CsVMV-GFP
2.4 启动子的5’连入调控序列MAR12,构建pBI121-CsVMV-MAR12和pBI121-CsVMV-GFP-MAR12
2.5 植物中间表达载体pUCM-T-GUS-GFP的构建
2.6 植物中间表达载体GUS的3’端连入调控序列MAR34,pUCM-T-GUS-GFP-MAR34的构建
2.7 将中间载体上GUS基因用F或F-KDEL基因替代,构建pUCM-T-GFP-F-MAR34和pUCM-T-GFP-F-KDEL-MAR34
2.8 植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34构建
2.9 植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建
2.10 植物表达载体pBI121-F转入到农杆菌
3 结果与分析
3.1 植物表达载体pBI121-F的构建
3.2 强启动子CsVMV替换pBI121原启动子CaMV35,构建表达载体pBI121-CsVMV
3.3 插入荧光标记基因GFP构建表达载体pBI121-CsVMV-GFP
3.4 启动子的5’连入调控序列MAR12,构建pBI121-CsVMV-MAR12和pBI121-CsVMV-GFP-MAR12
3.5 植物中间表达载体pUCM-T-GUS-GFP的构建
3.6 植物中间表达载体GUS的3’端连入调控序列MAR34,pUCM-T-GUS-GFP-MAR34的构建
3.7 将中间载体上GUS基因用F或F-KDEL基因替代,构建pUCM-T-GFP-F-MAR34和pUCM-T-GFP-F-KDEL-MAR34
3.8 植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34构建
3.9 植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建
3.10 植物表达载体pBI121-F转入到农杆菌
4 小结
第四章 农杆菌介导的苜蓿遗传转化
1 试验材料
1.1 供试品种
1.2 菌株和载体
1.3 培养基
1.4 主要生化试剂及其配置
2 试验方法
2.1 苜蓿子叶、下胚轴的准备
2.2 农杆菌EHA105、LBA4404的活化
2.3 根瘤农杆菌对苜蓿的遗传转化
2.4 外植体与农杆菌的共培养
2.5 再生植株的获得
2.6 再生植株的移植
2.7 数据处理
3 结果与分析
3.1 侵染时间对愈伤组织诱导率的影响
3.2 侵染后20d外植体组图
3.3 侵染后60d外植体组图
3.4 生根培养
4 小结
第五章 原生质体解离条件的初步探索
1 材料与方法
1.1 试验材料
2 试验方法
2.1 无菌苗的获得
2.2 原生质体的分离
2.3 原生质体的纯化
2.4 原生质体活力与产量测定
2.5 种子保存温度及酶解方式的选择
2.6 酶液组合和取材部位的选择
2.7 苗龄的选择
3 结果与分析
3.1 种子保存温度及酶解方式对原生质体游离效果的影响
3.2 酶液组合和取材部位对原生质体游离效果的影响
3.3 苗龄对原生质体游离效果的影响
4 小结
第六章 结论与讨论
1 酶切注意问题
1.1 双酶切位点的选择问题
1.2 分步酶切注意事项
2 单酶切去磷酸化注意问题
3 关于大片段回收注意事项
4 连接问题
5 影响农杆菌转化效率的因素分析
5.1 农杆菌的侵染时间对转化效率影响
5.2 高效受体的选择对转化效率影响
5.3 不同菌种对转化影响
6 原生质体解离条件探索的相关问题
6.1 种子打破休眠温度和振荡方式
6.2 种子取材部位和酶液组合
6.3 苗龄对原生质体游离效果的影响
7 展望
参考文献
附录
英文缩写词表
致谢
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