农杆菌介导小反刍兽疫病毒F基因转化苜蓿的研究

摘要

小反刍兽疫(PPR)是威胁我国小反刍兽健康的新型疾病，目前尚未找到有效的疫苗防治方法，所以本试验拟研制经济、实用、高效的PPR转基因苜蓿疫苗。首先是构建小反刍兽疫病毒(PPRV)的高效表达载体，采用农杆菌介导法，将F基因转入苜蓿，并且初步探索了原生质体这种高效表达受体的初步解离条件，为研制PPR的转基因植物疫苗奠定基础。 PPRV高效表达载体的构建，首先从PPRV质粒中扩增出F基因，在F基因终止密码子前加入KDEL序列，形成F-KDEL;烟草SRI中扩增出促进外源基因表达的MAR12序列和MAR34序列;pHL005质粒中扩增出报告基因GFP，一种绿色荧光蛋白基因，并对以上扩增产物进行了TA克隆;启动子CsVMV是采用人工合成的方法获得。以上基因或序列均带有相应酶切位点，从试验结果可见，所克隆的基因和序列条带大小均与理论大小相符，证明各元件克隆成功。 植物表达载体构建,酶SmaⅠ和SacⅠ分步酶切pBI121和酶PvuⅡ和BstxⅠ分步酶切pUCM-T-F，构建载体pBI121-F;将pBI121的启动子CaMV35S替换成在苜蓿中高效表达的CsVMV启动子，HindⅢ和XbaⅠ分别双酶切质粒PBI121和质粒pUCM-T-CsVMV构建表达载体pBI121-CsVMV，以提高目的基因的表达效率;用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pBI121-CsVMV和pUCM-T-GFP，目的是将GFP基因插入到pBI121-CsVMV中，构建pBI121-CsVMV-GFP载体，便于植物的活体检测;将促进外源基因表达的序列MAR12和pBI121-CsVMV-GFP载体HindⅢ单酶切，并对酶切后的pBI121-CsVMV-GFP去磷酸化处理，选择正向连接，构建载体pBI121-CsVMV-GFP-MAR12;酶HindⅢ分别酶切质粒pBI121-CsVMV和pUCM-T-MAR12，酶切后对pBI121-CsVMV去磷酸化处理，选择正向连接，构建载体pBI121-CsVMV-MAR12。 植物中间表达载体构建，用XbaⅠ和EcoRⅠ分别酶切pBI121-CsVMV-GFP-MAR12质粒和pUCM-T-GFP质粒，连接构建中间表达载体pUCM-T-GUS-GFP; EcoRⅠ单酶切pUCM-T-GUS-GFP，对其去磷酸化处理，用MunⅠ和EcoRⅠ分步酶切pUCM-T-MA(R)34,将两酶切后载体进行连接得到中间载体pUCM-T-GUS-GFP-MAR34;将载体pUCM-T-GUS-GFP-MAR34用酶SmaⅠ和SacⅠ双酶切，载体pUCM-T-F/F-KDEL分别用酶PvuⅡ和BstxⅠ分步酶切，连接构建中间表达载体pUCM-T-GFP-F/F-KDEL-MAR34。 最终表达载体的构建，用酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别双酶切中间表达载体pUCM-T-GFP-F/F-KDEL-MAR34和pBI121-CsVMV-MAR12，连接构建载体pBI121-CsVMV-MAR12-F/F-KDEL-MAR34;用酶XbaⅠ和EcoRⅠ分别双酶切质粒pBI121-CsVMV-GFP-MAR12和 pUCM-GUS-GFP-MAR34，连接构建载体pBI121-CsVMV-GFP-MAR12-F/F-KDEL-MAR34。 以上构建好的载体均已经酶切验证，并PCR检测，均为正确连接。分别是:pBI121-CsVMV-GUS-GFP-F-MAR12-MAR34;pBI121-CsVMV-GUS-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34;pBI121-CsVMV-GUS-F-MAR12-MAR34;pBI121-CsVMV-GUS-F-KDEL-MAR12-MAR34;pBI121-F。 表达载体构建成功后，运用冻融法将载体pBI121-F分别转入农杆菌LBA4404和EHA105中，经酶切、PCR检测成功转入。用含有表达载体的两种农杆菌分别侵染中苜3号苜蓿的子叶和下胚轴，结果显示15min为最佳侵染时间，菌种EHA105侵染后的愈伤分化率显著高于LBA4404(p＜0.05)。试验将分化的愈伤培育成苗，由于苗龄太小，还未对其进行提取DNA验证，今后需要进一步验证。 在转基因高效受体的选择上原生质体目前受到国内外专家的关注，因为原生质体是单细胞系统不易形成嵌合体，可以提高表达效率，性状易纯化且遗传稳定。所以本试验也对原生质体的游离条件做了初步探索。试验结果显示，以-70℃保存过夜的种子，取第7d的子叶以振荡的方式进行酶解，酶液组合为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.3％离析酶，对原生质体的游离效果最合适。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 小反刍兽疫的国内外研究现状及发展动态分析

1．1 小反刍兽疫病简介

1．2 小反刍兽疫病毒国内外诊断技术研究现状

1．3 小反刍兽疫防控发展动态分析

2 转基因植物疫苗的研究现状

2．1 转基因植物疫苗概况

2．2 转基因植物疫苗应用实例

2．3 转基因植物疫苗的利弊

2．4 转基因植物疫苗的前景展望

3 苜蓿遗传转化方法研究进展

3．1 农杆菌介导法

3．2 基因枪法

3．3 花粉管通道法

4 苜蓿遗传转化高效受体的选择

5 苜蓿基因工程的前景和局限性

6 目的意义

第二章 小反刍兽疫病毒F基因及表达载体相关序列克隆

1 试验材料

1．1 菌株、DNA和质粒

1．2 载体

1．3 酶与化学试剂

1．4 仪器耗材

2 试验方法

2．1 目的基因的PCR扩增

2．2 各基因和DNA片段TA克隆

2．3 重组质粒的鉴定

3 结果与分析

3．1 目的基因片段PCR扩增结果

3．2 重组质粒酶切鉴定

4 小结

第三章 植物表达载体的构建

1 试验材料

1．1 菌株与载体

1．2 酶和试剂

1．3 仪器耗材

2 试验方法

2．1 植物表达载体pBI121-F的构建

2．2 强启动子CsVMV替换pBI121原启动子CaMV35，构建表达载体pBI121-CsVMV

2．3 插入荧光标记基因GFP构建表达载体pBI121-CsVMV-GFP

2．4 启动子的5’连入调控序列MAR12，构建pBI121-CsVMV-MAR12和pBI121-CsVMV-GFP-MAR12

2．5 植物中间表达载体pUCM-T-GUS-GFP的构建

2．6 植物中间表达载体GUS的3’端连入调控序列MAR34，pUCM-T-GUS-GFP-MAR34的构建

2．7 将中间载体上GUS基因用F或F-KDEL基因替代，构建pUCM-T-GFP-F-MAR34和pUCM-T-GFP-F-KDEL-MAR34

2．8 植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

2．9 植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

2．10 植物表达载体pBI121-F转入到农杆菌

3 结果与分析

3．1 植物表达载体pBI121-F的构建

3．2 强启动子CsVMV替换pBI121原启动子CaMV35，构建表达载体pBI121-CsVMV

3．3 插入荧光标记基因GFP构建表达载体pBI121-CsVMV-GFP

3．4 启动子的5’连入调控序列MAR12，构建pBI121-CsVMV-MAR12和pBI121-CsVMV-GFP-MAR12

3．5 植物中间表达载体pUCM-T-GUS-GFP的构建

3．6 植物中间表达载体GUS的3’端连入调控序列MAR34，pUCM-T-GUS-GFP-MAR34的构建

3．7 将中间载体上GUS基因用F或F-KDEL基因替代，构建pUCM-T-GFP-F-MAR34和pUCM-T-GFP-F-KDEL-MAR34

3．8 植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

3．9 植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

3．10 植物表达载体pBI121-F转入到农杆菌

4 小结

第四章 农杆菌介导的苜蓿遗传转化

1 试验材料

1．1 供试品种

1．2 菌株和载体

1．3 培养基

1．4 主要生化试剂及其配置

2 试验方法

2．1 苜蓿子叶、下胚轴的准备

2．2 农杆菌EHA105、LBA4404的活化

2．3 根瘤农杆菌对苜蓿的遗传转化

2．4 外植体与农杆菌的共培养

2．5 再生植株的获得

2．6 再生植株的移植

2．7 数据处理

3 结果与分析

3．1 侵染时间对愈伤组织诱导率的影响

3．2 侵染后20d外植体组图

3．3 侵染后60d外植体组图

3．4 生根培养

4 小结

第五章 原生质体解离条件的初步探索

1 材料与方法

1．1 试验材料

2 试验方法

2．1 无菌苗的获得

2．2 原生质体的分离

2．3 原生质体的纯化

2．4 原生质体活力与产量测定

2．5 种子保存温度及酶解方式的选择

2．6 酶液组合和取材部位的选择

2．7 苗龄的选择

3 结果与分析

3．1 种子保存温度及酶解方式对原生质体游离效果的影响

3．2 酶液组合和取材部位对原生质体游离效果的影响

3．3 苗龄对原生质体游离效果的影响

4 小结

第六章 结论与讨论

1 酶切注意问题

1．1 双酶切位点的选择问题

1．2 分步酶切注意事项

2 单酶切去磷酸化注意问题

3 关于大片段回收注意事项

4 连接问题

5 影响农杆菌转化效率的因素分析

5．1 农杆菌的侵染时间对转化效率影响

5．2 高效受体的选择对转化效率影响

5．3 不同菌种对转化影响

6 原生质体解离条件探索的相关问题

6．1 种子打破休眠温度和振荡方式

6．2 种子取材部位和酶液组合

6．3 苗龄对原生质体游离效果的影响

7 展望

参考文献

附录

英文缩写词表

致谢

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