尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡易感性升高的机制

摘要

目的:随着国际空间站的逐步建成与我国载人航天活动的快速发展,参加中长期航天飞行的航天员日益增多,中长期航天飞行引起了航天员机体发生广泛的适应性改变,当返回1G重力环境的地面时,由于再适应失调,主要表现为立位耐力不良与运动能力降低。正是因为航天员站立时出现立位耐力不良,引起血中儿茶酚胺浓度代偿性大幅增加,过高的代偿性儿茶酚胺可能导致心肌的损害,这是在中长期航天飞行返回地面恢复初期值得关注、且需积极防护的重点工作之一。因此,本研究拟观测尾部悬吊4周及其恢复期大鼠心肌细胞凋亡率是否改变,同时探讨心肌细胞凋亡易感性升高的分子机制。
　　方法:以尾部悬吊4周大鼠及尾部悬吊4周后恢复1天的大鼠为研究对象,采用ELISA法测量大鼠血浆与左心室组织匀浆中去甲肾上腺素的含量,TUNEL法检测心肌细胞凋亡率。分离与培养成年大鼠原代心肌细胞,细胞免疫荧光技术和Western blot技术检测各种蛋白质的细胞内定位和表达情况。采用caseinzymography法检测calpains蛋白酶活性变化。采用siRNA技术沉默心肌细胞内calpain-1与calpain-2蛋白的表达,钙荧光探针Fluo3/AM标记细胞内游离Ca2+并用激光共聚焦显微镜检测Ca2+浓度的变化,用DHE荧光探针检测心肌细胞内活性氧含量的变化,免疫共沉淀技术检测calpain-2和CaMKⅡδB之间的相互作用,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位的变化。
　　结果:
　　1尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡易感性升高
　　尾部悬吊恢复期组大鼠血浆与左心室组织匀浆中去甲肾上腺素含量较对照组与尾部悬吊组显著增加。尾部悬吊恢复期组大鼠与β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素(ISO)刺激的尾部悬吊组心肌细胞凋亡率较对照组与尾部悬吊组显著增加,这一现象可被b-肾上腺素受体抑制剂心得安(Propranolol)及钙蛋白酶(calpains)抑制剂PD150606阻断。
　　2 Calpain-2是尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡易感性增加的关键调控分子
　　尾部悬吊4周组大鼠心肌ca lpa in-1与c a lpa in-2的表达未见改变,但尾部悬吊组大鼠心肌组织ca lpa in-2活性显著增加;同时发现尾部悬吊组大鼠心肌细胞ca lp a in-2在细胞核内的聚积较对照组显著增加,加入 ISO刺激可促进尾部悬吊组大鼠心肌细胞ca lpa in-2核转位。尾部悬吊4周组大鼠心肌细胞核中ca lp a in-2的表达与活性较对照组均呈显著性增加,且加入ISO可促进尾部悬吊组大鼠心肌细胞核ca lpa in-2表达与活性增加。加入calpa ins抑制剂P D150606处理后,可将升高的心肌细胞凋亡率水平降至未受 ISO刺激的尾部悬吊组大鼠心肌细胞凋亡率水平,并减少 ISO引起的ca lpa in-2核转位;沉默ca lpa in-1与c a lpa in-2基因表达后发现, ISO处理可显著升高转染了calpain-1 siRNA的尾部悬吊组大鼠心肌细胞凋亡率,相反的,用ISO处理转染了calpain-2 siRNA的尾部悬吊组大鼠心肌细胞,其凋亡率并未升高。
　　3核质网与活性氧共同参与调控尾部悬吊大鼠心肌细胞calpain-2的激活
　　无论ISO刺激与否,L-型钙离子通道(L-type calcium channels,LTCC)a1C、雷喏啶受体2(Ryanodine receptor,RyR2)和肌质网Ca2+-ATP酶2(Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA2)在对照组与尾部悬吊组均沿T管呈横纹分布,其荧光强度亦无明显差别;而用ISO处理后,PLB在对照组与尾部悬吊组大鼠心肌细胞核膜的聚集程度明显升高,且尾部悬吊组大鼠心肌细胞核膜PLB的聚集程度又高于对照组,同时发现ISO诱导的磷酸化Ser16-PLB在尾部悬吊组大鼠心肌细胞核膜的聚集程度也高于对照组。本研究还发现 ISO刺激后,对于对照组与尾部悬吊组大鼠心肌细胞的静息钙荧光强度并无影响,但却升高了这两组心肌细胞胞浆钙荧光强度峰值,且ISO处理后还可显著升高尾部悬吊组大鼠心肌细胞的核钙荧光强度峰值。尾部悬吊恢复组较对照组活性氧含量显著增加,且ISO处理后,超氧阴离子(O2·-)水平在尾部悬吊组与尾部悬吊恢复组大鼠心肌细胞内均显著升高。
　　4 Calpain-2经线粒体凋亡通路介导尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡
　　在尾部悬吊恢复组和ISO处理的尾部悬吊组大鼠心肌细胞中,细胞核内calp a in-2的表达明显增多且激活的calpain-2增多,同时核内的CaMKⅡδB的总量降低,且细胞核内CaMKⅡδB随着细胞核内激活的calpain-2的增多而减少,而calpain-2结合CaMKⅡδB增加;使用calpains抑制剂PD150606可阻断细胞核内CaMKⅡdB蛋白的降解。尾部悬吊恢复组和ISO处理的尾部悬吊组大鼠心肌细胞caspase-3(激活型)和caspase-9(激活型)蛋白表达均显著升高,心肌细胞线粒体膜电位(Δψm)均呈现去极化状态(绿色荧光),心肌细胞胞浆内的Cyto C释放明显增加,且Cyto C与线粒体共定位显著减少,Bc l-2/Ba x比值明显降低,而PD150606可阻断这些现象。
　　结论:本研究证实尾部悬吊4周恢复1天大鼠心肌细胞凋亡率增高,其机制为:恢复期高浓度儿茶酚胺可使核膜受磷蛋白磷酸化并增加核钙瞬变峰值。核内增加的Ca2+会进一步激活转位至核内的calpain-2,核内的calpain-2被激活后降解其底物CaMKⅡδB,从而使Bcl-2的表达减少,线粒体凋亡通路被激活,导致尾部悬吊大鼠心肌细胞的凋亡易感性增加,从而诱导心肌细胞凋亡。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

正文

第一部分 尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡率的变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡易感性增加的关键性分子靶点

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 尾部悬吊大鼠心肌细胞calpain-2激活的机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 激活calpai n-2介导尾部悬吊大鼠心肌细胞凋亡的通路

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢