PCV2不同亚型毒力差异分析及Rep蛋白N--糖基化位点突变体重组质粒的构建

摘要

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小的、二十面对称体、无囊膜、单链负股环状DNA病毒，是目前发现的最小DNA的动物病毒之一。该病毒1974年由德国学者Tischer等首次从猪肾传代细胞(PK15)的污染物中分离到的，1982年被命名为猪圆环病毒。猪圆环病毒分为两个血清型:PCV1和PCV2，PCV1没有致病性，PCV2具有致病性。PCV2能引起断奶仔猪多系统综合症(PMWS)、猪呼吸道病综合征(PRDC)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。PCV2的传播给养猪业造成巨大的经济损失，严重制约了养猪业的发展。 从山东省不同地区疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染的病料中得到7株PCV2流行株全序列(Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7)，并进行了全序列测定与分析。结果表明:7株PCV2流行株中Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-6、Y-7有较高同源性，为96.0％～100％,Y-5与Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-6、Y-7同源性较低，为70.6％～70.9％;进化树分析显示，Y-5与其他6株病毒遗传关系较远，分属于两个不同的大的分支;Y-1与参考毒株GX株(AY556475)同源性达99.2％; Y-4与参考毒株HB株(AY291317)同源性达99.2％;Y-5与参考毒株FJ株(AY556474)同源性达99.3％。ORF1、ORF2的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列均高度保守。表明山东地区流行的PCV2遗传关系比较近，与国内不同地区流行的PCV2有较高的同源性。 本研究在实验室前期构建的平台上，用PCV2a和PCV2b的拯救毒株分别对Balb/c小鼠进行攻毒试验，进行抗体、病毒含量的检测和组织病变的观察。PCV2a和PCV2b接种小鼠后，小鼠抗体水平均有提高，但PCV2b攻毒组的抗体水平要高于PCV2a攻毒组的抗体水平;PCV2b在小鼠各脏器中的含量要高于PCV2a在小鼠各脏器中的含量;PCV2b攻毒组病理变化比PCV2a组严重。表明猪圆环病毒2型特异性基序与病毒毒力相关，PCV2b的毒力强于PCV2a。 为研究PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点对病毒复制和致病性的影响，本研究以实验室前期构建的，含有PCV2全基因组的重组质粒pEASY-Blunt-PCV2为最初模板，利用重叠PCR的方法，对PCV2Rep蛋白上N-糖基化位点23aa-25aa(NPS)，256aa-258aa(NQT)和286aa-288aa(NAT)分别进行单点、双点和三点突变（将N突变为D），构建了7株突变体感染性克隆。得到单点、双点和三点突变的突变体感染性克隆共7株，分别为A、B、C、D、E、F、G，并对感染性克隆进行鉴定，为后续的研究打下了基础。

目录

声明

摘要

前言

文献综述

试验一 山东省不同地区PCV2分离株全基因序列分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

试验二 PCV2a和PCV2b毒力差异研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

试验三 PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变体感染性克隆的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

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致谢

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在读期间科研学术成果