NLRP3/Caspase-1在牙髓组织中的表达及其与牙髓损伤修复的关系研究

摘要

NLRP3是NOD样受体(NOD-like receptors,NODs)家族中目前研究较为深入的内源性蛋白,是重要的固有免疫受体。已经证实在小肠等组织发生炎症反应时,NLRP3可活化组装为多蛋白复合物——炎症复合体,该复合体能调节多种微生物及危险信号引起的免疫反应,通过剪切半胱氨酸蛋白酶1前体蛋白(pro-cysteiny laspartate specific proteinase 1,pro-Caspase-1)活化白细胞介素1家族(Interleykin-1 family,IL-1family)细胞因子的分泌,参与机体炎症反应。
　　当细菌及毒素侵入牙髓时,可以引起牙髓组织的免疫应答,推测NLRP3/Caspase-1通路在牙髓组织识别病原微生物,启动固有免疫防御的过程中有重要作用。本研究通过免疫荧光染色、蛋白印记(Western Blotting,WB)、实时逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcripiton polymerase chain reaction,RT-qPCR)等方法对不同状态下的人牙髓及不同时间点大鼠牙髓炎模型牙髓组织中NLRP3/Caspase-1、IL-1β的表达进行检测,同时观察该炎症体通路与牙髓组织矿化修复的关系。
　　1.NLRP3/Caspase-1通路在人牙髓组织中的表达
　　收集新鲜拔除成人恒牙牙髓,分别通过免疫荧光染色观察其在牙髓组织中的分布,Western Blotting定量分析NLRP3、Caspase-1蛋白的表达,RT-qPCR检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因水平在各组牙髓组织中的变化,同时研究牙髓组织修复相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的变化并分析与炎症体通路的关系。免疫荧光染色显示NLRP3、Caspase-1在正常牙髓组织成牙本质细胞中表达,而炎症牙髓中成牙本质细胞、免疫细胞、牙髓成纤维细胞均表达NLRP3、Caspase-1蛋白。WB结果可见正常及炎症牙髓组织中均表达NLRP3及pro-caspase-1蛋白,但后者NLRP3蛋白含量明显增高,caspase-1活化。荧光实时定量结果发现NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因在牙髓炎组明显升高,与WB结果一致,而矿化相关基因在此时明显降低。NLRP3/Caspase-1在牙髓组织中的分布及量的变化表明该通路可能在牙齿免疫防御中发挥作用。在由龋病到牙髓炎的进展中,牙髓组织的矿化修复过程与炎症过程并存,早期牙髓组织对刺激的应答以修复反应为主,细菌侵入牙髓组织发展为不可逆性牙髓炎时,炎症相关因子表达增高抑制牙髓组织的矿化反应,组织损伤修复能力下降。
　　2.NLRP3/Caspase-1在大鼠牙髓炎模型中的表达
　　采用单纯暴露髓腔的方法构建大鼠牙髓炎模型,依据牙髓暴露在口腔中的时间进行分组,观察牙髓炎症发展状态以及NLRP3/Caspase-1通路在大鼠牙髓炎过程中的变化情况。苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)显示,单纯髓腔暴露能够模拟牙髓炎发展过程。采用免疫荧光染色证实NLRP3/Caspase-1在炎症牙髓中存在。RT-qPCR在基因水平验证了该通路变化趋势,炎症初期NLRP3基因显著增加,随后增幅减弱,而caspase-1、IL-1β基因变化趋势与NLRP3基本一致。

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第一部分 NLRP3/Caspase-1在人正常和感染牙髓组织中的表达研究

实验一 免疫荧光染色检测NLRP3/Caspase-1在牙髓中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Western Blotting 检测NLRP3/Caspase-1在牙髓中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 实时荧光定量研究NLRP3/Caspase-1与牙髓损伤修复的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 NLRP3/Caspase-1通路在牙髓炎症中表达的体内研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢