ALDH2在1型糖尿病诱导的心肌损伤中的保护作用及新机制

摘要

研究背景：
　　糖尿病是一种代谢紊乱性疾病,其并发症可引起全身多系统损害且预后极差,对社会和经济带来沉重的负担。流行病学资料表明,糖尿病是心血管疾病的等危症。如何减轻1型糖尿病对心肌造成的损害,降低患者病死率,提高其生活质量是目前亟待解决的重要问题。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是存在于线粒体内的一种重要的醛类氧化酶,能够催化乙醇代谢产物乙醛氧化为乙酸,并且氧化分解乙醛衍生物4-壬烯醛(4-HNE)为无毒性的相应酸,减轻醛类氧化酶对细胞造成的损伤。最新研究表明,ALDH2除对醛类的解毒作用外,对多种应激因素导致的心肌损伤均具有保护作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)存在于真核生物中,是ALDH2重要的下游分子,参与细胞能量代谢、自噬等多种生物学活动。研究表明,ALDH2通过AMPK信号通路对缺血再灌注导致的心肌损伤发挥保护作用;ALDH2选择性激动剂Alda-1通过激活AMPK信号通路有效改善酒精引起的心肌损伤。然而,ALDH2在1型糖尿病诱导的心肌损伤中的作用及机制目前尚不清楚。最新研究发现,在STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型中观察到自噬标志蛋白表达水平下降,提示自噬下调很可能是高糖导致心肌损伤的重要原因机制,但是目前尚无研究表明ALDH2对高糖导致的心肌细胞自噬水平的影响。
　　因此,我们拟对如下问题进行研究:①ALDH2在1型糖尿病诱导的心肌损伤中的作用;②ALDH2的这种作用是否通过AMPK信号通路调节自噬来实现的,为防治糖尿病心肌损伤提供新的策略和治疗靶点。
　　研究目的：
　　通过在体和细胞水平观察ALDH2对1型糖尿病诱导的心肌功能及细胞存活、凋亡、线粒体膜电位及细胞内自噬水平的影响,探讨ALDH2是否通过激活AMPK信号通路调节自噬保护1型糖尿病诱导的心肌损伤,进一步明确自噬在ALDH2心肌保护作用中的地位,阐明ALDH2在1型糖尿病心肌损伤中的保护作用机制,为其作为有效的心肌保护靶点提供理论依据。
　　研究方法：
　　采用腹腔注射STZ的方法诱导1型糖尿病模型,检测心肌收缩舒张功能、心肌内Ca2+瞬变、组织学染色检测心肌横截面积,通过western blot检测心肌组织中自噬标志蛋白及其上游相关蛋白表达水平。以30mmol/L葡萄糖诱导培养H9C2心肌细胞48h,经ALDH2选择性激动剂Alda-1(20μM)、自噬抑制剂3-MA(10mM)、自噬激活剂Rapamycin(Rapa,100nM)及AMPK抑制剂Compound C(CC,10mM)干预后,用MTT法检测细胞存活率,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡及JC-1检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位,western blot检测P62、Atg7、LC3B自噬标志蛋白及自噬上游重要调控蛋白ULK1、AMPK和FoxO3a表达及磷酸化水平。
　　研究结果：
　　(1)ALDH2过表达小鼠可部分抵消FVB-STZ组小鼠心肌细胞收缩、舒张功能异常;糖尿病小鼠心肌细胞内Ca2+蓄积及清除能力下降均被ALDH2过表达部分恢复;组织学染色表明,STZ诱导糖尿病小鼠心肌肥厚,ALDH2过表达小鼠心肌肥厚程度显著减轻;糖尿病导致小鼠心肌组织中P62和叉头转录因子3a(Forkhead box O3a,FoxO3a)磷酸化表达增加,Atg7、LC3B和AMPK磷酸化表达显著降低,而ALDH2过表达可部分逆转上述蛋白的表达变化(P<0.05)。
　　(2)与对照组相比,高浓度葡萄糖培养H9C2心肌细胞后,细胞存活率、线粒体膜电位显著降低,凋亡数量明显升高,P62表达和FoxO3a磷酸化水平明显上调,Atg7、LC3B表达和AMPK、ULK1磷酸化水平显著降低(P<0.05);
　　(3)ALDH2选择性激动剂Alda-1显著提高高糖诱导的H9C2心肌细胞存活率,改善线粒体功能,降低细胞凋亡率,降低高糖导致的P62和p-FoxO3a蛋白表达的升高,增加Atg7、LC3B蛋白表达和AMPK、ULK1蛋白磷酸化(P<0.05);
　　(4)自噬抑制剂3-MA部分抵消Alda-1对细胞的保护作用,而自噬激活剂Rapa对高糖导致的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用(P<0.05);为明确高糖抑制细胞自噬的分子机制,采用AMPK抑制剂CC干预H9C2心肌细胞,提示:CC部分抵消Alda-1对高糖导致的心肌细胞损伤的保护作用,且下调自噬相关蛋白的表达(P<0.05)。
　　结论：
　　ALDH2对1型糖尿病诱导的心肌损伤具有保护作用,这种保护作用是通过激活AMPK信号通路,上调细胞自噬水平实现的。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、糖尿病心肌病

二、ALDH2的研究进展

三、自噬在心血管疾病研究中的发展

四、研究目的

正文

第一部分 ALDH2在1型糖尿病诱导的心肌损伤中的保护作用

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

第二部分 ALDH2通过调节自噬保护高糖导致的心肌细胞损伤的机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢