Notch3对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化抑制作用的研究

摘要

研究背景:
　　心肌纤维化(MF)是多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理改变,也是心肌重构的主要表现之一。心肌成纤维细胞(CFs)占心脏间质细胞的90％。在心肌受损后的结构代偿中,CFs增殖及分化,分泌胶原,参与组织修复。然而进行性发展的心肌纤维化将引起心室重构,导致心脏功能障碍。在心肌纤维化过程中,CFs分化为肌成纤维细胞(MFs)是其中一个重要机制。
　　Notch是近年来发现与细胞组织分化密切相关的信号通路分子。Notch受体有4个亚型(Notchl-4),它们通过与邻近细胞间的相互作用来精确调控各谱系细胞的分化及各器官的病理生理过程,但其调控机制目前尚不明确。近年来一些研究报道,Notch信号通路参与许多纤维化疾病,然而在心肌纤维化中的研究尚未开展。
　　研究目的:
　　1.CFs向MFs转化时,Notch3表达量是否发生变化?
　　2.Notch3表达抑制后,能否促进CFs向MFs转化?
　　3.Notch3表达上调后,能否抑制CFs向MFs转化?
　　研究方法:
　　1.用胶原酶和胰酶混合消化法分离培养原代SD仔鼠的CFs,培养24h后,将其分别于含0,1,2,5,10ng/ml5个不同浓度的TGF-β1培养液诱导24h,用Western blot检测CFs中平滑肌肌动蛋白(α-SMA),用免疫荧光法检测α-SMA在CFs中的表达,检测细胞上清羟脯氨酸含量;用Real Time PCR及Western blot检测Notch3 mRNA及蛋白的表达变化。
　　2.用原代培养的SD仔鼠的CFs,培养24h后,用RNAi法干扰CFs中Notch3的表达,实验分为3组:即空白对照组,阴性对照组,siRNA干扰组。72h后,用Real Time PCR及Western blot检测干扰效果,Western blot检测α-SMA蛋白表达量,用免疫荧光法检测α-SMA在CFs中的表达情况,检测各组细胞上清羟脯氨酸含量。
　　3.用原代培养的SD仔鼠的CFs,培养24h后,利用构建的过表达Notch3慢病毒转染CFs,实验分为5组:即空白对照组,阴性对照组,Notch3过表达组,TGF-β1诱导组,TGF-β1诱导+Notch3过表达组。72h后,用Real Time PCR及Western blot检测转染效果,Western blot检测α-SMA蛋白表达量,用免疫荧光法检测α-SMA在CFs中的表达情况,检测各组细胞上清羟脯氨酸含量。
　　实验结果:
　　1.采用胶原酶和胰酶混合消化法,成功分离培养SD仔鼠CFs。使用含10%胎牛血清低糖DMEM正常培养24h,用倒置显微镜观察细胞形态,可见细胞形态多样,为多突的纺锤形或星型的扁平细胞,无自发搏动,核呈卵圆形、居中。
　　2.正常培养CFs24h,使用无血清低糖DMEM同步化培养24h,再用含0,1,2,5,10ng/ml5个不同浓度的TGF-β1的培养液培养24h。检测各组CFs细胞细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达量随TGF-β1浓度升高而增加,Notch3 mRNA及蛋白表达量随TGF-β1浓度升高而降低。其中2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml3个浓度组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。提示TGF-β1能浓度依赖增加CFs向MFs转化,同时抑制Notch3表达。
　　3.正常培养CFs24h,使用无血清低糖DMEM同步化培养24h,再使用Notch3的siRNA对CFs进行干扰,与对照组相比,干扰组Notch3 mRNA及蛋白表达下降(P<0.05),同时,干扰组细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达增加(P<0.05)。提示Notch3表达下调后,CFs向MFs转化增加。
　　4.利用不同滴度阴性对照病毒对CFs转染,当复感染指数(MOI)为20,转染72h时,荧光显微镜观察转染效率大约80%左右。因此,本实验以MOI=20进行病毒转染。
　　5.正常培养CFs24h,使用无血清低糖DMEM同步化24h,再使用过表达Notch3慢病毒转染,同时加入10ng/ml TGF-β1诱导12h组及10ng/mlTGF-β1诱导24h后再转染Notch3组,与空白对照组相比,过表达组Notch3 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达减少(P<0.05),TGF-β1诱导组Notch3蛋白表达均下降(P<0.05),细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达升高(P<0.05),而与对照组相比,TGF-β1+Notch3组无明显差异。该结果提示过表达Notch3后,能抑制CFs向MFs转化。
　　结论:
　　Notch3表达下调能诱导CFs向MFs转化。过表达Notch3能抑制CFs向MFs转化。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1.心肌纤维化概况

2.心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞细胞转化在心肌纤维化中的作用

3. 调控心肌纤维化的细胞因子

4.Notch信号通路概况

正文

1材料

1.1实验主要试剂

1.2实验主要仪器

2方法

2.1溶液配制

2.2乳鼠心肌成纤维细胞的分离与培养

2.3免疫荧光

2.4 Western Blot

2.5 Real Time PCR

2.6 siRNA转染实验

2.7细胞上清羟脯氨酸含量测定实验

2.8慢病毒转染实验

2.9统计学处理

3结果

3.1心肌成纤维细胞的形态学观察

3.2不同浓度TGF-β1诱导24h后，对CFs向MFs转化的影响

3.3不同浓度TGF-β1诱导24h后，对CFs中Notch3表达量变化的影响

3.4 siRNA干扰Notch3表达对CFs向MFs转化的影响

3.5 Notch3过表达对CFs向MFs转化的影响

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢