第一部分 单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）诱导肾小管上皮—肌成纤维细胞转化的作用及机制探讨;第二部分 雷帕霉素对肾间质纤维化和肾小管上皮—肌成纤维细胞转化的抑制作用

摘要

本研究旨在观察MCP-1对Snail、Erk1/2、P38MAPK、RhoA、RhoC mRNA、蛋白表达水平的影响，以进一步探讨MCP-1对诱导肾小管上皮细胞发生EMT的细胞一分子机制。 方法： 实验一，观察MCP-1诱导体外培养的HK-2细胞发生EMT的剂量、时间依赖关系：细胞分为阴性对照组、阳性对照组(TGF β-1，5 ng/ml)、MCP-1作用组(0.1，1，10，100 ng/ml)，刺激48h后，分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、WesternBlot方法检测肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA、蛋白表达的变化，并以产生最大效应的刺激浓度作用不同时间(12h、24h、48h、72h)观察MCP-1刺激与α-SMA表达水平之间的变化。 实验二，观察Erk1/2、P38MAPK、Rho在MCP-1诱导EMT的作用中的变化。 1、观察不同浓度MCP-1诱导HK-2细胞PErk1/2、Erk1/2、P-P38MAPK、P38MAPK、RhoA蛋白水平和RhoC基因水平的变化。HK-2细胞分为阴性对照组、MCP-1作用组(0.1，1，10，100 ng/ml)，刺激5min，用Western Blot方法检测肾小管上皮细胞PErk1/2、Erk1/2、P-P38MAPK、P38MAPK、RhoA蛋白水平的变化，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RhoC基因水平的变化。以(PErk1/2)/(Erk1/2)二者比值的变化表示Erk1/2信号转导蛋白磷酸化水平的变化；以(P-P38MAPK)/(P38MAPK)二者比值的变化表示P38MAPK信号转导蛋白磷酸化水平的变化。 2、分别观察Erk、P38MAPK、Rho信号通路的阻断剂对MCP-1诱导的EMT的影响。分为阴性对照组、MCP-1(1ng/ml)阳性对照组、MCP-1+DMSO共同作用组(DMSO为PD98059、SB203580的溶剂)、各阻断剂与MCP-1(1ng/ml)共同作用组，即分别应用不同浓度的Erk、P38MAPK、Rho信号转导通路的特异性阻断剂PD98059(50umol/l、100umol/l)、SB203580(10umol/l、50umol/l)、Y27632(1 umol/l、10umol/l)预先作用于HK-2细胞1h，再加入MCP-1(1ng/ml)共同作用48h，用Western Blot方法检测α-SMA蛋白表达水平。 实验三：HK-2细胞分为阴性对照组、不同浓度MCP-1作用组(0.1，1，10，100 ng/ml)，刺激5min，RT-PCR方法检测Snail基因水平的变化。 结果： 实验一：RT-PCR、Western Blot方法发现体外培养的HK-2细胞在不同浓度刺激下，1 ng/ml MCP-1刺激48小时α-SMAmRNA及蛋白表达水平最强，表现为浓度、时问依赖性。 实验二：Western Blot方法检测，与阴性对照组比较，在不同浓度MCP-1组(0.1，1，10，100 ng/ml)刺激5min时，HK-2细胞(PErk1/2)/(Erk1/2)二者比值即Erk1/2磷酸化水平呈上升趋势，表现为浓度依赖性，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)。HK.2细胞(P-P38MAPK)/(P38MAPK)比值即P38MAPK磷酸化水平呈上升趋势，表现为浓度依赖性，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR及Western Blot方法检测不同浓度MCP-1刺激下RhoA蛋白水平和RhoC基因表达水平与阴性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。应用不同浓度PD98059(50umol/l、100umol/l)预处理细胞1h，均可以部分阻断MCP-1诱导的肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达水平，与阳性对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)；而应用不同浓度SB203580(10umol/l、50umol/l)及Y27632(1umol/l、10umol/l)预处理细胞1h，均不能阻断MCP-1诱导的肾小管上皮细胞内α-SMA蛋白表达水平，与阳性对照组相比，各组无显著性差异(P>0.05)。 实验三：RT-PCR方法证实，MCP-1(10，100 ng/ml)刺激组Snail基因表达水平明显升高，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。 结论：MCP-1诱导体外培养的HK-2细胞发生肾小管上皮一肌成纤维细胞转化可能与上调Erk1/2信号转导通路以及上调Snail转录因子水平有关，本研究未能证实该机制与P38MAPK信号通路及Rho信号转导通路有关。

目录

论文说明：主要英文缩写词

第一部分摘要

第一部分英文摘要

第二部分摘要

第二部分英文摘要

第一部分单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）诱导肾小管上皮—肌成纤维细胞转化的作用及机制探讨

研究背景

第一节MCP-1诱导肾小管上皮—肌成纤维细胞转化的作用

一、实验材料

二、实验试剂的配制

三、实验方法

四、数据处理方法

五、实验结果

小结

第二节、MCP-1诱导肾小管上皮细胞EMT机制探讨

一、实验材料、仪器

二、实验方法及数据处理

三实验结果

小结

讨论

参考文献

第二部分雷帕霉素对肾间质纤维化和肾小管上皮—肌成纤维细胞转化的抑制作用

研究背景

第一节雷帕霉素对肾小管上皮细胞EMT的抑制作用

一、实验材料

二、实验试剂的配制

三、实验方法

四、数据处理方法

五、结果

小结

第二节雷帕霉素对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞—肌成纤维细胞转化和肾间质纤维化的抑制作用

一、前言

二、材料与方法

二、实验试剂的配制

三、实验方法

四、数据处理方法

五、结果

小结

讨论

参考文献

综述 肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的信号转导途径

个人简历

致谢