宫颈癌辐射抵抗相关miRNAs的筛选及初步功能研究

摘要

背景和研究目的：
　　宫颈癌(cervical carcinoma,CC)是发展中国家女性第一高发恶性肿瘤,放射治疗是宫颈癌治疗的重要手段之一。然而,接受根治性放疗的局部晚期宫颈癌患者仍然有30％左右出现肿瘤复发和转移,导致治疗失败。其肿瘤细胞或肿瘤辐射抵抗特性可能是放疗后复发或转移的主要原因。研究表明引起肿瘤的辐射抵抗机制十分复杂,目前认为可能包括肿瘤细胞DNA损伤与修复异常、低氧环境和低氧诱导因子形成、肿瘤干细胞的存在、以及相关的microRNAs产生等多种因素。深入研究肿瘤辐射抵抗的形成机制或分子网络,对于有效改善肿瘤辐射治疗质量具有重要意义。
　　microRNAs(miRNAs)是近年来研究的热点,是真核生物体内一种内源性的非编码小RNA,在体内主要发挥基因沉默作用。大量研究显示,miRNA和多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。已有报道显示异常表达的miRNA与白血病、肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌等疾病的化疗抵抗、复发转移及预后密切相关。但是,miRNA异常表达与宫颈癌辐射敏感型或辐射抵抗的关系,尚有待研究阐明。本研究首先通过具有辐射敏感性差别的宫颈癌组织,筛选宫颈癌辐射抗性相关miRNAs,然后通过宫颈癌细胞培养和基因转染等技术,进行miRNA的功能验证和效应机制探讨,为临床预测宫颈癌放疗预后、逆转宫颈癌辐射抵抗、提高肿瘤治愈率提供新的思路和依据。
　　材料和方法：
　　1.选择我科八例宫颈癌患者组织标本,三例放疗后三年内无复发转移患者为对照组(辐射敏感组),三例局部复发、两例转移患者为实验组(辐射抵抗组)。采用美国 Affymetrix公司 microRNA芯片进行基因表达谱的差异性筛选,数据库版本和图像分析软件分别为miRBase Release20和GenePix pro V6.0。
　　2.采用实时荧光定量RT-PCR技术对基因芯片结果进行验证,并在宫颈癌辐射敏感及宫颈癌辐射抵抗的组织标本中,对所选差异表达miRNA表达水平进行验证。
　　3.采用基因转染方法,经特异miRNA前体和抑制物上调或下调HeLa及SiHa宫颈癌细胞miRNA表达水平,CCK-8、克隆形成、划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术等观察辐射后细胞增殖、侵袭能力、细胞凋亡及细胞周期变化。
　　4.采用多个生物信息网站对 miR-4778-3p可能调控的下游靶基因进行初步预测,查阅相关文献,对miR-4778-3p调控辐射抵抗的可能机制进行初步探索。
　　5.研究结果采用SPSS17.0软件进行统计学处理,采用独立样本的t检验,P<0.05差异有统计学意义。
　　主要结果：
　　1.通过miRNA芯片筛选,共获得32个与宫颈癌辐射抵抗相关的差异表达miRNA分子,差异性表达均在2倍以上(p<0.05);与辐射敏感组织相比,在复发患者中发生表达上调miRNA分子共10个,表达下调9个。在远转患者中表达上调9个,表达下调4个。其中,miR-4778-3p在复发及转移患者中的表达水平均明显下调。RT-PCR结果与芯片结果具有良好一致性,结果表明miR-4778-3p在复发转移患者肿瘤组织中表达降低(p<0.01)。
　　2.使用特异性miR-4778-3p前体或抑制物转染宫颈癌细胞系HeLa及SiHa使其表达水平升高或降低后发现,与对照细胞相比,上调 miR-4778-3p的表达显著抑制细胞辐射后的增殖活力、克隆形成和侵袭能力,而下调miR-4778-3p的表达水平后,宫颈癌细胞系的细胞活力显著增加。然而,与对照组相比,改变 miR-4778-3p的表达水平,对辐照诱导的细胞凋亡和细胞周期无影响。
　　3.通过生物学靶基因预测分析,初步结果显示XRCC2、IRS2、IGF2BP2、CDH2、MEMO1、MYH7、ASH1及Slit1等靶基因可能受到miR-4778-3p的下游调控。但对于其确切调节作用和机制,需要进一步的实验验证。
　　初步结论：
　　1.本研究发现miR-4778-3p宫颈癌辐射敏感及辐射抵抗组织中表达水平有显著差异,细胞实验上调或下调 miR-4778-3p能够降低或升高宫颈癌细胞辐照后细胞活力及增殖能力,提示miR-4778-3p可能是调节宫颈癌辐射抗性的重要因子。
　　2.初步表明miR-4778-3p可能通过靶向调控XRCC2、IRS2、IGF2BP2、CDH2、MEMO1、MYH7、ASH1及Slit1蛋白表达水平,影响宫颈癌细胞的辐射敏感性。但miR-4778-3p调控宫颈癌辐射抗性的确切下游机制问题,仍有待进一步深入研究。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、 宫颈癌概述

二、 辐射抵抗的机制研究

三、 miRNA概论

四、 miRNA与宫颈癌

五、 miRNA与辐射抵抗

第一部分 宫颈癌辐射抵抗相关miRNAs分子的筛选与验证

1 实验材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 MiR-4778-3p对宫颈癌细胞系辐射后功能学影响及初步机制探索

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢