硫醇转移酶在糖尿病性白内障形成中作用的研究

摘要

目的：
　　硫醇转移酶(Thioltransferase，TTase)对维持晶状体氧化还原平衡状态有重要作用。本研究通过观察糖尿病性白内障和年龄相关性白内障，及不同类型年龄相关性白内障晶状体前囊膜中 TTase含量与活性，分析其与临床资料的相关性，探讨硫醇转移酶在糖尿病性白内障形成中可能的作用。建立链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠白内障的模型，观察大鼠晶状体的形态和相关生化指标改变与TTase变化的关系，进一步探讨 TTase在糖尿病性白内障形成中的作用；采用不同浓度和时间高糖处理晶状体上皮细胞，观察细胞 TTase表达和活性的变化，研究与细胞生化指标和凋亡相关蛋白的关系，探讨TTase在高糖引起的细胞氧化损伤中可能的作用。
　　方法：
　　1．分别收集行白内障超声乳化术的糖尿病性白内障晶状体前囊膜108例和年龄相关性白内障108例，分40-55岁，56-65岁，66-80岁三个年龄段，Western blot检测晶状体前囊膜 TTase蛋白质的含量，TTase活性及谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量；分析糖尿病性白内障晶状体前囊膜TTase活性与患者年龄、病程、视力、血糖、糖化血红蛋白、GSH等资料的相关性；分析50-60岁年龄相关性白内障（核性、皮质性和混合性白内障）晶状体前囊膜的TTase表达和活性[1]。
　　2．取雄性SD大鼠30只，随机分为2组，随机选择15只为糖尿病组，按65mg/kg的剂量给予注射链脲佐菌素（STZ），溶解于0.02 mol/L枸橼酸钠缓冲液，对照组给予注射等量枸橼酸钠缓冲液。STZ后72小时，血糖浓度达到16.7 mmol/L认为造模成功；定期监测各组大鼠体重、血糖，每周用1％浓度复方托品酰胺眼液散瞳后，在裂隙灯下观察并记录其晶状体混浊程度的变化情况。12周后处死大鼠，取出眼球，分离晶状体，放-80℃备用。Western blot检测两组大鼠的晶状体中TTase表达，用试剂检测其活性的变化。采用DTNB显色法测量和计算晶状体中GSH及GSSG的含量。SPSS统计软件分析TTase与晶状体混浊程度、GSH、GSSG的关系。
　　3．将晶状体上皮细胞（HLE B3）系用不同浓度葡萄糖培养（5.5mM、15.5mM，25.5mM和35.5mM葡萄糖和高渗甘露醇对照组）。高糖刺激细胞24小时后搜集细胞，检测TTase表达，建立浓度曲线。根据浓度梯度结果，选择35.5mM葡萄糖为实验浓度处理晶状体上皮细胞，分别在0h，2h，8h，16h，24h时间点搜集细胞，检测TTase表达和活性，建立时间曲线。同时检测0h，2h，8h，16h，24h细胞GSSG和GSH，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot检测与凋亡相关的蛋白Bax和Caspase-3的表达。
　　结果：
　　1．TTase活性在40-55岁组糖尿病晶状体前囊膜中（2.36±0.78 mU/mg protein）表达高于同龄组年龄相关性白内障组(2.64±0.83 mU/mg protein)（P＜0.05），而在56岁以上组间无显著性差异；TTase蛋白质表达结果与活性相似；多因素相关性分析显示TTase蛋白质表达和活性与糖尿病患者的年龄（R=-0.755）、病程（R=-0.515）、糖化血红蛋白（R=-0.607）、糖尿病视网膜病变的程度（R=-0.438）、GSH（R=0.730）和GSSG（R=-0.438）相关，与空腹血糖（R=-0.147）、视力（R=0.199）、白内障类型（R=-0.134）无关；不同类型年龄相关性白内障：皮质性（2.24±0.87 mU/mg protein）、核性（2.14±0.61 mU/mg protein）和混合性（2.09±0.76 mU/mg protein）白内障晶状体前囊膜中TTase活性无显著性差异[1]。
　　2．注射STZ后72小时，糖尿病组大鼠血糖较正常对照组显著增高（P<0.01），并出现多饮、体重下降。散瞳裂隙灯下观察结果显示，STZ注射后第4周，糖尿病大鼠晶状体逐渐开始发生混浊，第8周之前晶状体混浊程度进展比较缓慢，8周以后混浊快速进展。正常组大鼠体重始终保持较高水平，糖尿病大鼠体重较对照组低（P＜0.01），4周以后晶状体混浊程度明显重于对照组大鼠（P＜0.05），正常对照组大鼠晶状体始终保持透明。12周后检测晶状体GSH的含量糖尿病组（28.31±4.76 umol/g protein）较对照组（52.97±6.44 umol/g protein）下降了约50%（P＜0.05），GSSG含量（6.94±1.40 umol/g protein）则较对照组（2.03±0.45 umol/g protein）显著增加（P＜0.05）。Western blot显示，糖尿病组大鼠晶状体TTase的表达较对照组显著降低（P＜0.05），活性（0.81±0.27U/g protein）也明显低于对照组（1.26±0.29U/g protein）（P＜0.05），且与GSH正相关（R=0.593，P＜0.05），与晶状体混浊程度和GSSG呈负相关（R=-0.541，P＜0.05）。
　　3．TTase蛋白质表达随葡萄糖浓度增加逐渐增强，在35.5 mM葡萄糖组中最强，高渗对照组甘露醇组无明显变化。TTase活性在35.5 mM葡萄糖处理后2h开始升高（5.41±0.91mU/mg protein），8h达到高峰（9.47±1.22mU/mg protein）较对照组（4.83±0.62mU/mg protein）显著增高（P<0.05），然后逐渐下降。GSH在加入高糖16h后(7.41±0.92 nmol/mg protein)较对照组（10.33±1.56nmol/mg protein）显著下降（P<0.05）。而GSSG和GSSG/T-GSH比值随时间逐渐增加，2h后开始升高分别为0.78±0.082 nmol/mg protein和6.38±0.72%，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），8h后继续增加（P<0.05），到24h时GSSG达到1.23±0.15nmol/mg protein，GSSG/T-GSH为12.1±1.49%（P<0.05）。而高糖（35.5 mM）处理晶状体上皮细胞24h后，与对照组相比细胞凋亡情况不显著，细胞凋亡相关蛋白Bax随时间表达上调，Pro-Caspase3表达逐渐下降。
　　结论：
　　1．晶状体前囊膜TTase表达与活性在年轻糖尿病患者较年龄相关性白内障患者增高；TTase活性与糖尿病患者的年龄、病程、糖化血红蛋白、GSH和GSSG、糖尿病视网膜病变的程度相关，可能在糖尿病性白内障的形成中有重要的保护作用；而不同类型年龄相关性白内障的形成与TTase关系不明显[1]。
　　2．腹腔注射STZ可诱导糖尿病大鼠出现明显的晶状体混浊，GSH的含量下降，GSSG增高，同时TTase的表达和活性降低，且与晶状体的混浊程度和GSH、GSSG的变化相关，提示TTase协同参与糖尿病大鼠白内障形成中氧化损伤的机制。
　　3．高糖处理晶状体上皮细胞可诱发TTase表达快速上调，并呈浓度依赖性，同时伴GSH的含量下降，GSSG增加，凋亡相关蛋白表达变化，提示TTase可能参与细胞对高糖刺激的反应，且与高血糖引起的晶状体上皮细胞氧化损伤和凋亡有关，并可能对细胞有一定保护作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、糖尿病性白内障的发病机制

二、氧化损伤与白内障

三、硫醇转移酶的研究进展

四、糖尿病性白内障的防治现状与展望

第一部分 硫醇转移酶在糖尿病性白内障晶状体中表达及临床相关因素分析的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 STZ诱导糖尿病大鼠晶状体硫醇转移酶变化的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 高糖诱导晶状体上皮细胞硫醇转移酶的变化及相关生化改变

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

附录