‘富士’苹果红色芽变果实金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

摘要

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类能够结合重金属的富含半胱氨酸(Cys)低分子量蛋白质，广泛分布于生物界，目前已从多种生物中克隆到了金属硫蛋白基因，很多研究表明，金属硫蛋白的表达在不同的组织和不同的生长发育时期存在着明显的基因差异，而且其在植物生长中的作用目前不是十分明确。本研究从本实验室构建的‘富士’苹果红色芽变果实的SSH文库中克隆出两个金属硫蛋白基因，利用实时荧光定量PCR技术，对这两个金属硫蛋白基因在不同部位和不同时期的表达进行了初步研究，构建了原核表达载体并诱导融合蛋白表达，为以后苹果金属硫蛋白的获得和研究奠定了基础，此外还构建了植物双元表达载体和植物亚细胞定位表达载体，以方便进一步研究苹果金属硫蛋白基因在植物生长发育过程中的作用和金属硫蛋白基因在植物细胞中的表达部位。 1苹果金属硫蛋白基因（MdMT2、MdMT3）的克隆 本文根据从构建好的SSH文库中获得的EST序列为模板，设计引物，利用RACE PCR技术，获得两个金属硫蛋白基因的cDNA全长，分别将其命名为MdMT2和MdMT3。MdMT2的全长为639bp，基因内部包括一个长度为240bp可编码79个氨基酸的开放阅读框(ORF)，MdMT3的全长为495bp，基因内部包括一个长度为201bp可编码66个氨基酸的开放阅读框(ORF)。 2 MdMT2、MdMT3基因编码的蛋白的生物学分析 利用相关生物分析软件和程序分析基因编码的蛋白的结构特点和性质，MdMT2蛋白预测的蛋白分子量为7793.8Da，等电点为4.75，分子式为C297H483N91O114S20，且MdMT2具有一个Metallothio_2 superfamily结构功能域，跨膜预测分析MdMT2蛋白是膜间蛋白。MdMT3预测的蛋白分子量为6929.7Da，等电点为4.78，分子式为C275H442N82O103S12，跨膜预测分析MdMT3蛋白为膜内蛋白。 3 Real-time PCR分析MdMT2、MdMT3基因的表达 采用实时荧光定量PCR技术，分别分析了MdMT2、MdMT3基因在苹果果实发育不同时期的果皮中的表达差异和在叶片、花、茎，果皮、果肉五个不同器官部位中的表达差异，结果表明MdMT2在芽变富士和普通富士中的表达趋势一致，都是在成熟果皮中的相对表达量最高，但在芽变富士中的表达量明显高于普通富士。MdMT3在芽变富士和普通富士中的表达趋势也是一致的，是在成熟果实的果肉中表达量最高，而且也是芽变富士的表达量明显高于普通富士。 4 MdMT2、MdMT3基因原核表达载体的构建和诱导表达 根据目的基因和载体特点设计带有酶切位点的引物，经PCR扩增、酶切、连接和转化等操作将苹果金属硫蛋白基因和原核表达载体PET-41a片段连接，成功构建原核表达载体PET41 a-MT2和PET41a-MT3。并转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达，获得了PET41 a-MT3融合蛋白，分子量分别约为37kD。并从IPTG浓度和诱导表达时间二个方面优化重组蛋白的表达体系。 5植物双元表达载体和植物亚细胞定位载体的构建与转化 根据目的片段和载体特点设计带有酶切位点的引物，经PCR扩增、酶切、连接和转化后，将苹果金属硫蛋白基因分别于植物双元表达载体PBI121和植物亚细胞定位表达载体PBI121-GFP片段连接，成功构建植物双元表达载体PBI121-MdMT2、PBI121-MdMT3与植物亚细胞定位表达载体PB I121-GFP-MdMT2、PBI121-GFP-MdMT3。

目录

声明

摘要

前言

1 苹果果皮颜色

1．1 果皮颜色的市场价值

1．2 苹果的类黄酮物质及其作用

1．3 苹果果皮的着色模式

2 影响苹果花青素积累的因素

2．1 光照

2．2 温度

2．3 矿质营养

2．4 糖类的作用

2．5 生长调节剂

2．6 果园管理措施

2．7 采后的储藏条件

3 影响果树芽变的分子机理

3．1 DNA甲基化状态的改变

3．2 反转录转座子的插入

3．3 基因结构的突变

4 金属硫蛋白的发现与作用

4．1 植物金属硫蛋白的分类

4．2 植物金属硫蛋白基因的表达

4．3 植物金属硫蛋白的功能

5 目的和意义

第一章 苹果金属硫蛋白基MdMT2、MdMT3的克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 苹果果皮RNA的提取

2．2 MdMT2基因的克隆及序列分析

2．3 MdMT3基因的克隆及序列分析

3 讨论

第二章 苹果金属硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同采样时期果皮中花青苷含量的测定

2．2 MdMT2、MdMT3的相对表达量分析

3 讨论

第三章 苹果金属硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的原核表达

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 克隆载体与克隆片段的制备

2．2 重组质粒的检测

2．3 融合蛋白的表达

3 讨论

第四章 苹果金属硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的真核表达载体的构建

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 克隆载体与克隆片段的制备

2．2 重组质粒的检测

参考文献

缩略词(Abbreviation)

致谢