电针预处理通过CB1R调控神经元GluR2诱导脑缺血耐受作用的研究

摘要

脑卒中是导致人类死亡与残疾最重要的病因之一,其主要的病理生理学改变是严重的组织缺血损伤。脑组织遭遇缺血损伤时,神经元突触前膜会迅速释放大量的兴奋性氨基酸--谷氨酸,谷氨酸的堆积又使突触后膜谷氨酸受体过度激活,引发严重的兴奋毒性,造成神经元死亡。过量的谷氨酸主要激活突触后膜上2种谷氨酸受体:α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸盐受体(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate receptor,AMPAR)和天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)。大量研究证实AMPAR广泛分布于中枢神经系统,但其表达有明显的区域性差别,海马CA1区锥体神经元表达最高,表明AMPAR与全脑缺血后海马组织的特异性神经元死亡有着更加密切的关系。AMPAR是由GluR1-GluR4四种亚基围绕一个亲水中心孔道组合而成的五聚体结构,其中GluR2决定了AMPAR的钙离子通透性。全脑缺血损伤后,GluR2蛋白表达下调,使得大量钙离子经过通透性已改变的AMPAR进入相对脆弱的海马CA1区锥体神经元,使胞内钙超载,引发一系列致死反应,造成神经元死亡。许多学者曾利用AMPAR拮抗剂治疗缺血性脑损伤,然而都因阻断AMPAR过度激活的同时也破坏了AMPAR正常生理功能,均以失败告终。然而因AMPAR GluR2亚基具有独特的调节钙离子通透性的作用,故该亚基可能成为针对AMPAR治疗脑缺血损伤的新靶点。
　　有学者在爪蟾卵母细胞中发现,内源性大麻素花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)可以直接与AMPAR作用,抑制AMPAR的亚基重组,这提示了内源性大麻素与谷氨酸受体有着一定的关系。另有细胞实验发现激活神经元AMPAR,可引起内源性大麻素AEA及2-花生酰基甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG)合成增加,减弱兴奋毒性对神经元造成的损伤;而应用减弱内源性大麻素消耗的摄取抑制剂UCM707,可通过激活大麻素Ⅰ型受体(cannabinoid receptor1,CB1R)与大麻素Ⅱ型受体(cannabinoid receptor2,CB2R),抵抗兴奋毒性损伤。此外,有在体研究报道,红藻氨酸诱导的兴奋毒性使得野生型小鼠海马组织中内源性大麻素的含量迅速上调,从而保护小鼠海马神经元免受兴奋毒性损伤;而在CB1R基因敲除小鼠脑内,该保护作用消失。还有动物实验发现,给予CB1激动剂WIN55212-2,可以减少突触前膜谷氨酸的释放,而CB1R抑制剂SR141716A抵消该作用,这表明内源性大麻素可通过CB1R抑制谷氨酸能的突触传递。这一系列结果说明,由AMPAR过度激活诱导的兴奋毒性可以应激性的使内源性大麻素合成增加,抵抗兴奋毒性,从而保护神经元,而这一作用与CB1R关系密切。
　　我实验室前期研究证实在动物百会穴给予缺血前电针预处理,可以激活内源性大麻素系统,上调内源性大麻素配体AEA与2-AG,通过激活的大麻素受体发挥神经保护作用。但是电针预处理诱导脑缺血耐受的机制仍需进一步探索。
　　基于以上背景,本实验利用C57BL/6小鼠短暂全脑缺血模型,观察电针预处理是否通过CB1R调节GluR2,发挥缺血后脑保护作用,以求进一步完善电针预处理诱导脑缺血耐受的机制,并且为针对AMPAR治疗脑中风带来新的视角与契机。
　　实验一:电针预处理对全脑缺血损伤后海马GluR2表达的影响
　　目的:全脑缺血损伤后,海马神经元GluR2蛋白表达下降,引起胞内钙超载,造成神经元死亡。本实验预观察电针预处理是否可影响全脑缺血后海马神经元GluR2的蛋白表达。
　　方法:
　　1.全脑缺血再灌后不同时间点海马神经元GluR2的表达水平
　　成年雄性C57小鼠30只(18-22g),随机分为2组:假手术组(Sham)、模型组(I/R),小鼠缺血再灌后2h、6h、24h、48h、72 h将动物处死取脑,利用Western blotting,测定不同时间点海马神经元GluR2的蛋白表达水平。
　　2.电针预处理对缺血后海马神经元GluR2表达的影响
　　成年雄性C57小鼠20只随机分为4组:假手术组(Sham)、缺血组(Con)、电针(EA)预处理组(EA+GCI)、单纯电针组(EA)。小鼠缺血再灌后2h处死取脑及冰冻切片,运用Western blotting及免疫荧光染色测定海马神经元GluR2的蛋白表达变化。
　　结果:
　　1.短暂全脑缺血再灌注后2h,海马区GluR2表达明显减少。
　　Western blotting显示,与Sham组比较,I/R组2h可见GluR2在海马组织的表达明显降低(P<0.05),其他时间点组间蛋白表达量无统计学差异。
　　2.电针预处理有效上调短暂性全脑缺血损伤后海马CA1区锥体神经元上GluR2蛋白的表达。
　　Western blotting结果显示,与Con组比较,EA+GCI组海马组织中GluR2蛋白表达明显上调(P<0.05),Sham组和EA组无统计学差异。免疫荧光双标染色结果显示,GluR2主要表达于海马CA1区锥体细胞膜。
　　结论:全脑缺血再灌注2h,海马组织GluR2蛋白表达明显降低;电针预处理可上调全脑缺血后海马神经元GluR2的蛋白表达。
　　实验二:海马GluR2参与电针预处理诱导脑保护作用的研究
　　目的:实验一证实电针预处理可上调缺血后海马组织GluR2的蛋白表达,但该亚基的蛋白表达变化是否影响电针预处理脑保护作用不得而知。本实验探索海马组织GluR2是否参与电针预处理脑保护作用。
　　方法:
　　1.GluR2siRNA干涉海马神经元GluR2表达的效果验证
　　成年雄性 C57小鼠15只随机分为3组:空白对照组(Sham)、siRNA干涉组(siRNA)、乱序对照组(scRNA)。海马定位注射后,72h后取脑,行Western blotting检测海马神经元GluR2表达变化。
　　2.干涉GluR2表达对电针预处理脑保护作用的影响
　　成年雄性C57小鼠20只随机分为4组:假手术组(Sham)、缺血组(Con)、电针处理组(EA+GCI)、GluR2干涉+电针组(siRNA+ EA+GCI)。小鼠缺血再灌后24h行神经功能学评分和灌注石蜡切片。评估各组小鼠神经功能,并行TUNEL染色和Nissl染色测定海马神经元凋亡及存活数目。
　　3.GluR2对缺血损伤后神经细胞凋亡蛋白的影响
　　成年雄性C57小鼠20只随机分为4组:假手术组(Sham)、缺血组(Con)、电针处理组(EA+GCI)、GluR2干涉+电针组(siRNA+EA+GCI)。动物经历缺血再灌注后24h处死取脑,运用Western blotting对凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达进行定量分析。
　　结果:
　　1.干涉海马组织GluR2蛋白表达可逆转电针预诱导的脑保护作用。
　　海马定位注射GluR2 siRNA72h后,siRNA组海马组织中GluR2蛋白表达显著低于Sham组与scRNA组(P<0.05),表明海马组织GluR2的蛋白表达被抑制。
　　小鼠全脑缺血再灌后24h,EA+GCI组小鼠的神经功能学评分明显优于 Con组(P<0.05),而与EA+GCI组比较,siRNA+ EA+GCI组神经功能学评分复又下降(P<0.05)。这表明抑制GluR2表达可逆转电针预处理对神经功能的改善作用。
　　小鼠全脑缺血再灌后24h,尼氏染色结果显示,EA+GCI组的神经元存活数目远大于Con组(P<0.05),siRNA+EA+GCI组存活神经元数目明显低于 EA+GCI组(P<0.05)。这表明抑制GluR2表达可逆转电针预处理抑制神经元死亡的作用。
　　2.海马神经元GluR2分子通过减少缺血损伤后神经元凋亡参与电针预处理脑保护作用。
　　小鼠全脑缺血再灌后24h,TUNEL结果显示,与Con组比较,EA+GCI组TUNEL阳性细胞数减少(P<0.05),干涉掉GluR2后,缺血再灌注损伤组织中TUNEL阳性细胞数量又明显增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,Con组凋亡蛋白Bax/Bcl-2比例较 Sham组明显升高,EA+GCI组该比例显著下降(P<0.05),siRNA+ EA+GCI组则又上调该比例(P<0.05)。
　　结论:上调海马神经元 GluR2的表达,可通过抑制缺血后神经元凋亡,参与电针预处理诱导的脑缺血耐受作用。
　　实验三:内源性大麻素2-AG预处理对脑缺血损伤后GluR2表达水平的影响
　　目的:以上实验证实电针预处理可上调全脑缺血后海马神经元GluR2蛋白表达发挥脑保护作用,但电针预处理通过何种机制影响GluR2的表达尚不清楚。我们以前的研究发现内源性大麻素系统是电针预处理脑保护作用的重要机制之一。故本实验欲观察内源性大麻素是否参与调控电针对海马神经元GluR2的影响。
　　方法:
　　2-AG预处理对海马神经元GluR2表达的影响及其可能机制
　　成年雄性C57小鼠20只随机分为4组:假手术组(Sham)、缺血组(Con)、2-AG处理组(2-AG)、2-AG+CB1受体抑制剂(AM251)组(AM251+2-AG)、溶剂组(V)。小鼠缺血再灌后2h处死取脑。运用Western blotting测定海马神经元GluR2的表达水平变化。
　　结果:
　　2-AG预处理可上调缺血损伤后GluR2的表达,而AM251可逆转这一作用。
　　Western blotting显示,与Con组比较,2-AG组GluR2在海马组织的表达明显升高(P<0.05);与2-AG组比较,AM251+2-AG组GluR2在海马组织的表达复又降低(P<0.05),V组和Sham组之间无统计学差异。
　　结论:内源性大麻素2-AG可上调海马神经元GluR2的蛋白表达,而大麻素受体CB1R可能是其介导分子,故电针预处理是通过内源性大麻素而影响GluR2的表达。
　　实验四:CB1R对电针预处理上调脑缺血后海马神经元GluR2蛋白表达的调控作用
　　目的:前三步实验表明电针预处理通过内源性大麻素影响缺血后GluR2的蛋白表达,但其具体调控机制仍不清楚。本实验探索电针预处理后 CB1R对缺血后海马神经元GluR2蛋白表达的影响。
　　方法:
　　1.CB1受体激动剂ACEA和WIN55212-2对缺血后海马神经元GluR2表达的影响
　　成年雄性C57小鼠25只随机分为5组:缺血组(Con)、电针处理组(EA+GCI)、CB1受体激动剂 ACEA组(ACEA+GCI)、CB1受体激动剂 WIN55212-2组(WIN55212-2+GCI)、溶剂组(V+GCI)。小鼠缺血再灌后2h处死取脑,行Western blotting检测GluR2表达变化。
　　2.CB1受体拮抗剂AM251和SR141716A对缺血后海马神经元GluR2表达的影响
　　成年雄性C57小鼠25只随机分为5组:缺血组(Con)、电针处理组(EA+GCI)、CB1受体拮抗剂 AM251组(AM251+EA+GCI)、CB1受体拮抗剂 SR141716A组(SR141716A+EA+GCI)、溶剂组(V+EA+GCI)。小鼠缺血再灌后2h处死取脑,行Western blotting检测GluR2表达变化。
　　结果:
　　1.CB1受体激动剂可模拟电针预处理对全脑缺血损伤后海马神经元GluR2分子的上调作用。
　　Western blotting结果显示，与Con组比较，CB1受体激动剂ACEA和WIN55212-2也可上调全脑缺血再灌后2h海马神经元GluR2的蛋白表达水平((P<0.05)。 V+GCI和Con组之间无统计学差异。
　　2.CB1受体拮抗剂可逆转电针预处理上调全脑缺血损伤后海马神经元GluR2蛋白表达的作用。
　　Western blotting结果显示，与EA+GCI组比较，AM251+EA+GCI组和SR141716A+EA+GCI组海马组织GluR2表达明显下降(P<0.05)。EA+GCI和V+EA+GCI组之间无统计学差异。
　　结论:电针预处理通过CB1R影响缺血后海马神经元GluR2的蛋白表达。
　　总结:
　　本实验发现电针预处理通过大麻素CB1R调节下游海马神经元GluR2分子的蛋白表达水平，影响神经元凋亡，诱导脑缺血耐受作用。这表明电针预处理可成为针对AMPAR的GluR2亚基，治疗动物全脑缺血再灌注损伤的新手段。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 兴奋毒性在脑缺血再灌注损伤中的作用

2 细胞凋亡、自噬、坏死在脑缺血再灌注损伤中的作用

3 谷氨酸受体的神经保护研究现状

4 电针预处理在脑缺血耐受作用中的研究

实验一、电针预处理对全脑缺血损伤后海马GluR2表达的影响

1 材料

2方法

3 结果

4. 讨论

实验二、海马GluR2参与电针预处理诱导脑保护作用的研究

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

实验三、内源性大麻素2-AG预处理对脑缺血损伤后GluR2表达水平的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四、CB1R在电针预处理上调脑缺血后海马神经元GluR2蛋白表达中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

研究成果

致谢