苹果MLO基因家族和甘露糖结合凝集素基因的克隆及表达分析

摘要

以苹果茎和叶为试材，克隆得到苹果的MLO基因家族和甘露糖结合凝集素基因，通过生物信息学分析和荧光定量表达分析，初步探讨MLO基因和甘露糖结合凝集素基因的功能，获得的研究结果如下: 1、通过RT-PCR的方法从苹果中克隆出MLO家族中的5个成员，分别命名为MdMLO1、MdMLO2、MdMLO3、MdMLO4、MdMLO5;其编码蛋白与其他物种MLO蛋白构建进化树分析将MLO蛋白分为6个亚家族;MdMLO1属于Ⅱ亚家族，MdMLO2和MdMLO3属于Ⅴ亚家族，MdMLO4属于Ⅰ亚家族，MdMLO5属于Ⅵ亚家族;荧光定量结果表明:MLO基因在苹果不同组织中都有着各自的表达模式;在受到苹果白粉病病原胁迫时MdMLO2和MdMLO3表达显著上调，推测MdMLO2和MdMLO3与白粉病发病有关;同时受到机械损伤胁迫和外源SA、MeJA及ACC诱导时，MdMLO1、MdMLO2、MdMLO3、MdMLO4和MdMLO5都有各自的调控模式，推测MdMLO1、MdMLO2、MdMLO3、MdMLO4和MdMLO5参与了机械损伤胁迫和外源SA、MeJA及ACC诱导胁迫过程。 2、以苹果幼叶为试验材料，通过同源克隆和RT-PCR方法分离出B LECTIN基因家族中的一个基因，命名为MdMBL。分析结果表明，克隆得到的MdMBL长度为1181bp，包括20bp的5啡编码区、81bp的3'非编码区和一个长度为1080bp编码359个氨基酸的开放阅读框，推测该蛋白质分子量为39.76kD，其等电点为8.72。在构建的MBL系统进化树中，MdMBL与葡萄的MBL的关系最近，其次为橹豆的MBL，与苹果的MBL2同源基因进化关系最远。相对荧光定量RT-PCR分析表明，MdMBL具有组织特异性，在茎中表达量最高，在花中表达量最低;低温胁迫促使MdMBL表达量升高，MdMBL在机械损伤处理下表达量先升高在降低;外源SA能够诱导MdMBL表达上调。

目录

声明

摘要

前言

1．植物白粉病研究相关研究进展

1．1．植物白粉病研究概况

1．2．苹果白粉病

2．植物抗病基因研究

2．1．植物抗病基因

2．2．MLO基因的研究进展

2．3．植物抗病相关的信号转导途径

2．4．细胞间信号转导

2．5．SA依赖性信号转导途径

2．6．SA非依赖信号转导途径(JA／ETH依赖性途径)

3．甘露糖集合凝集素研究进展

3．1．MBL的结构特点

3．2．MBL的功能及应用

4．研究目的、意义、内容与技术路线

4．1．研究内容

4．2．研究目的与意义

4．3．技术路线

第一章 苹果白粉病MLO家族基因的克隆及表达分析

1．试验材料

1．1．植株材料

1．2．主要工具酶及试剂

1．3．质粒和菌株

1．4．试验仪器

2．试验方法

2．1．苹果幼叶及其它组织总RNA提取

2．2．RNA的完整性、纯度及质量检测

2．3．总RNA中DNA的消化

2．4．cDNA第一链的合成

2．5．目的基因的扩增

2．6．琼脂糖凝胶电泳目的片段的回收

2．7．大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

2．8．目的片段连接转化测序

2．9．苹果白粉病接种处理方法

2．10．外源激素处理方法

2．11．苹果MLO基因家族成员生物信息学分析

3．结果与分析

3．1．苹果各组织总RNA提取纯度检测

3．2．苹果MLO家族的cDNA的扩增和测序

3．3．苹果MLO家族基因的生物信息学分析

3．4．利用Real time-PCR对苹果MLO家族的表达分析

3．5．不同苹果品种MdMLO2基固的cDNA差异分析

4．讨论

第二章 苹果甘露糖结合凝集素基因的克隆及表达分析

1．材料与方法

1．1．植物材料

1．2．主要工具酶及试剂

1．3．质粒和菌株

1．4．试验仪器

2．试验方法

2．1．试验材料及处理方法

2．2．试验方法

2．3．基因表达定量方法

3．结果与分析

3．1．MdMBL的克隆及序列分析

3．2．MdMBL推导的氨基酸序列的同源性及系统进化分析

3．3．MdMBL的生物信息学分析

3．4．MdMBL在苹果不同组织中的表达分析

3．5．低温胁迫对苹果中MdMBL表达分析

3．6．机械损伤胁迫对苹果中MdMBL表达分析

3．7．外源SA诱导对苹果中MdMBL表达分析

4．讨论

参考文献

附录

英文缩略词

致谢