miR-15a在人膝关节软骨细胞中的表达及其对软骨细胞增殖与凋亡作用的研究

摘要

背景：
　　骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的关节退行性疾病,又称骨关节病、退行性关节炎。其病情进展与年龄相关,发病缓慢,对中老年人群的生活质量产生严重的影响,是老年人致残的重要因素。随着我国老龄化进程的加快,骨关节炎对家庭和全社会的影响和负担日益突出。骨关节炎的病因复杂,其危险因素包括年龄、体重、关节创伤等,目前对其发病机制还缺乏较深入的了解,不能较完整地阐明其本质。骨关节炎主要累及全身各活动关节,以髋关节、膝关节、踝关节等负重关节最为多见,其主要病理特征为受累关节的软骨细胞数量减少、关节软骨基质遭到破坏,病变涉及滑膜细胞、软骨、软骨下骨以及周围肌肉韧带等软组织,最终导致患者关节变形,关节功能障碍。
　　microRNA即微小RNA,是近年来发现的一类内源性的非编码单链RNA分子,进化上高度保守,长约17～25个核苷酸。microRNA广泛存在于动物植物体内,并能够以碱基互补配对的方式与其靶基因mRNA结合,进而降解靶基因或者抑制靶基因翻译过程,起到转录后调控的作用,是体内基因表达调控的重要分子。大量研究表明,microRNA参与调控炎症、肿瘤、生长发育等多种病理及生理过程,与此同时其在骨关节炎的发生发展及治疗中所起到的作用值得我们进一步深入了解。本实验以miR-15a为研究重点,探索其是否对骨关节炎的发病起到了调控作用。
　　目的：
　　1.验证miR-15a在正常人膝关节软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中的差异表达;
　　2.明确miR-15a对体外原代培养的人膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响;
　　3.明确 miR-15a对Ⅱ型胶原等功能蛋白在软骨细胞中表达的影响,初步阐释miR-15a在骨关节炎发生发展中起到的作用,为骨关节炎分子靶向治疗提供潜在的靶点和理论依据。
　　方法：
　　1.采用酶两步消化法获取并原代培养正常人膝关节软骨细胞,细胞单层爬片后采用甲苯胺蓝染色法、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色加以鉴定。
　　2.采用酶两步消化法获取并原代培养正常人膝关节软骨细胞与人骨关节炎软骨细胞,荧光实时定量PCR检测miR-15a在两种细胞中的表达量。
　　3.利用Lipofectamine2000转染试剂将人工化学合成的miR-15a模拟物(mimics)、无关阴性对照序列(Negative Control)瞬时转染原代培养的正常人膝关节软骨细胞,荧光实时定量PCR检测miR-15a在各实验组细胞中的表达。
　　4.转染miR-15a模拟物后,MTT比色法检测miR-15a对软骨细胞增殖的影响。
　　5.转染miR-15a模拟物后,流式细胞术检测miR-15a对软骨细胞凋亡的影响。
　　6.转染miR-15a模拟物后,Western blot检测miR-15a对软骨细胞Ⅱ型胶原表达水平的影响。
　　结果：
　　1.采用酶两步消化法获得了原代人膝关节软骨细胞,经甲苯胺蓝染色法、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定后,其纯度及生物学活性符合后续实验要求。
　　2.荧光实时定量PCR检测miR-15a在正常人膝关节软骨细胞与人骨关节炎软骨细胞中的表达量,结果显示 miR-15a在两种软骨细胞中差异表达,并且在骨关节炎软骨细胞中表达量明显增高,P<0.05。
　　3.利用Lipofectamine2000转染试剂,成功将miR-15a模拟物转染至体外培养的软骨细胞内,荧光显微镜下观察转染率大于90％,满足后续实验要求。
　　4.MTT实验结果提示与对照组相比,转染miR-15a模拟物后软骨细胞增殖速率显著降低,P<0.05。
　　5.流式细胞术实验结果提示与对照组相比,转染miR-15a模拟物后软骨细胞凋亡率显著增高,P<0.05。
　　6.Western blot结果提示与对照组相比,转染miR-15a模拟物后软骨细胞Ⅱ型胶原表达水平显著降低,P<0.05。
　　结论：
　　1.采用酶两步消化法可成功获得原代正常人膝关节软骨细胞与原代人骨关节炎膝关节软骨细胞,经鉴定后细胞纯度与所具有的功能表型可用于后续细胞学实验。
　　2.miR-15a在正常人膝关节软骨细胞与人骨关节炎软骨细胞中差异表达,在正常关节软骨细胞中表达量显著低于骨关节炎软骨细胞。
　　3.化学合成的miR-15a模拟物可高效地转染进体外培养的关节软骨细胞,可在96h内显著提高细胞内miR-15a的表达量。
　　4.miR-15a可抑制软骨细胞增殖,促进软骨细胞凋亡,提示miR-15a在骨关节炎的发病过程中扮演了重要的角色。
　　5.miR-15a可通过抑制软骨细胞中Ⅱ型胶原的合成,影响软骨基质的完整和生物学功能的稳定,促进骨关节炎的发病。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

正文

实验一 人膝关节软骨细胞体外原代培养的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 miR-15a在正常膝关节软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中表达水平的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 miR-15a对人膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 miR-15a对人关节软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白表达水平的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢