Sirt1介导RNA结合蛋白QKI的去乙酰化在饥饿肝脏能量平衡中的作用

摘要

肝脏在饥饿状态下的能量平衡调节中发挥了关键作用。饥饿早期,肝脏糖原迅速分解,维持正常的血糖浓度,同时,肝脏的糖异生也开始启动,一些非糖物质经肝脏转化后生成葡萄糖,入血后维持血糖浓度和提供能量。随着饥饿时间的延长,脂肪组织分解,提供甘油和脂肪酸。甘油可以作为糖异生的原料,而脂肪酸能被进一步氧化,为全身能量供应提供支持。肝脏在进行脂肪酸氧化过程中生成酮体,酮体入血后运送到全身多个组织器官为细胞提供能量。因此,肝脏在饥饿的能量平衡中发挥了核心作用,而这些能量平衡调控的深层次机制涉及到多种错综复杂的分子信号。换句话说,饥饿状态下,糖原分解、糖异生、脂肪酸氧化、酮体生成等供能效应,其本质是细胞分子信号通路在饥饿环境下的适应性调控过程。许多病理条件下,如糖尿病、脂肪肝等疾病,肝脏能量平衡相关信号转导发生障碍,异常的分子调控导致了疾病的发生、发展。为此,深入研究肝脏代谢分子机制,可以丰富分子代谢理论,同时,为疾病的诊治提供新的思路。
　　为适应环境变化,信号分子在表观遗传、转录、转录后、翻译、翻译后等水平的多重调节下发生自身表达和活性的改变,以便适应环境变化。饥饿时,肝脏中NAD依赖的蛋白去乙酰化酶Sirt1通过翻译后修饰(去乙酰化)促进PGC1α、FOXO1等代谢相关转录因子/转录共调节因子的活性,而活化的转录因子/转录共调节因子通过转录调节机制增加下游代谢相关酶的表达,促进长期饥饿下肝脏的糖异生和脂肪酸氧化,调节血糖的平衡和能量供应。可见,饥饿环境下,肝脏细胞中的代谢相关信号分子受到了不同层面的多重调控。
　　RNA结合蛋白介导的转录后调控在肝脏代谢中少有研究。STAR家族成员QKI(Quaking)是一个RNA结合蛋白,由qkI基因编码,可产生多个异构体,在全身多种组织细胞中表达。其中,QKI5主要定位于胞核,但也能穿梭到胞浆,而 QKI6和QKI7主要分布在胞浆中。通过与mRNA的3'UTR的特异性识别元件(QRE)结合,QKI在调节mRNA的胞浆/胞核定位、稳定性、翻译效率等方面发挥了关键作用。在神经系统,QKI能增加MBP的表达,从而增加髓鞘的形成。在结肠癌中,QKI通过影响β-catenin的亚细胞定位,发挥抑癌基因效应。我们发现,QKI同样在肝脏表达,而有关其在肝脏中的功能尚没有研究报道。
　　【目的】
　　(1)在体内和体外模型中,查看 QKI在肝脏饥饿能量平衡过程中的表达变化,分析QKI与糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成的相关性;
　　(2)在体内和体外模型中,探讨QKI是否受乙酰化修饰调节,并阐明QKI的乙酰化修饰在饥饿肝脏能量代谢中的作用;
　　(3)分析 QKI乙酰化修饰的上游调节分子机制,探讨上游调节分子如何影响QKI,并在饥饿肝脏代谢中发挥效应;
　　(4)分析受乙酰化修饰调节的QKI通过调节哪些下游关键分子,从而影响肝脏饥饿能量代谢,并进一步阐明QKI调节下游分子的深层次机制。
　　【方法和结果】
　　(1)在小鼠饥饿的肝脏组织、低糖和Forskolin/dexamethasone处理的HepG2细胞中,利用免疫组化、qRT-PCR和Western-blot检测QKI的表达变化。结果发现,肝脏中,QKI5是主要表达的异构体。与对照相比,QKI5的表达呈现升高的趋势。
　　(2)在上述饥饿模型中,使用乙酰化抗体进行免疫共沉淀(IP),Western-blot检测QKI5乙酰化水平;利用生物信息学技术预测QKI5可能的乙酰化修饰位点;构建乙酰化位点突变的QKI5表达载体,探讨乙酰化修饰的改变对饥饿肝脏能量代谢的影响。结果表明,QKI5在饥饿的肝脏中表现为去乙酰化状态,而使用突变载体干预发现,QKI5的KH domain区赖氨酸突变为精氨酸(MTR5,乙酰化位点缺失)时,促进肝脏糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成;突变为谷氨酰胺(MTQ5,相当于乙酰化的氨基酸),则抑制糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成。
　　(3)使用去乙酰化酶Sirt1的抑制剂和激活剂,IP试验检测肝脏细胞QKI5的乙酰化水平;在细胞中干涉Sirt1的表达,检测QKI5的乙酰化水平;在Sirt1敲除的小鼠肝脏中查看QKI5的乙酰化水平。结果表明,在肝细胞中抑制Sirt1的活性,QKI5乙酰化水平增加,促进Sirt1活化,则导致QKI5去乙酰化;在干涉Sirt1表达的肝细胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝脏组织中,QKI的乙酰化水平都是升高的。
　　(4)在肝脏细胞中干涉QKI5、过表达QKI5、MTR5、MTQ5,结合饥饿模型刺激,qRT-PCR检测肝脏代谢相关的关键分子的表达。结果发现,干涉QKI5或过表达MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表达,而过表达QKI5或MTR5则促进FOXO1和PPARα表达。通过RNA-IP实验发现,QKI5与FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。
　　(5)通过报告系统实验进一步验证QKI5、MTR5和MTQ5对FOXO1和PPARα的转录后调节机制。结果表明,过表达QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα报告基因的萤光素酶活性,而过表达MTQ5则抑制其活性。
　　【结论】
　　RNA结合蛋白QKI在饥饿肝脏能量代谢中发挥了重要作用。饥饿时,肝脏Sirt1促进了QKI的去乙酰化,去乙酰化的QKI通过转录后调节机制促进转录因子FOXO1和PPARα的表达,进而促进糖异生、脂肪酸氧化及酮体生成,从而在肝脏能量平衡中发挥作用。

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前言

文献回顾

1.肝脏与能量代谢平衡调节

2.转录后调节与QKI

正文

第一部分 RNA结合蛋白QKI在饥饿肝脏中的表达变化

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 饥饿条件下，肝脏QKI乙酰化修饰的初步探讨

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分 Sirt1对QKI乙酰化水平的影响

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

第四部分 不同水平QKI乙酰化修饰对肝细胞重要代谢分子的影响

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

第五部分 QKI影响肝脏饥饿代谢的机制探讨

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

第六部分 QKI对FOXO1和PPARα的转录后调节机制探讨

引言

1．材料与仪器

2.方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢