原发性胆汁性肝硬化的机制研究及愈肝方联合熊去氧胆酸的疗效评价

摘要

目的：
　　原发性胆汁性肝硬化（primary billary cirrhosis，PBC)的定义是一种进行性的，慢性的肝内胆汁淤积性疾病，是以肝细胞内中、小胆管的非化脓性炎症，以及在血清中抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibody，AMA)呈高滴度表现为主要特征的自身免疫性肝病，PBC发病机制仍未完全阐明，但公认的是，免疫因素在其发病机制中发挥着十分重要的作用。白细胞介素-33（Interleukin-33，IL-33）是一种在固有免疫和获得性免疫中均具有广泛效应的细胞因子。IL-33通过其受体ST2信号途径，促进了Th2类细胞因子、促炎细胞因子(IL-8、IL-1β)和组胺的释放。另外，能直接作用于中性粒细胞的IL-33，通过上调中性粒细胞表面趋化因子受体（CXCR2）的表达，从而增强中性粒细胞的迁移能力。
　　然而在PBC疾病研究中，有关IL-33的相关作用研究尚无相关报道，IL-33的表达特征及其对中性粒细胞的作用也不清楚，两者与PBC患者疾病的严重程度，以及肝脏组织学的严重程度的关系仍未阐明。本研究旨在通过初步观察PBC患者（Child-Pugh A级组21例、Child-Pugh B级组29例及Child-Pugh C级组18例）血清及肝组织内IL-33的表达水平及其分布水平，同时观察PBC患者肝脏组织中IL-33 mRNA的表达水平与肝组织中性粒细胞（MPO+细胞）的浸润水平的相关性，并进一步通过体外实验观察PBC患者外周血浆中IL-33对中性粒细胞的趋化作用，从而探讨IL-33与PBC患者疾病进展的可能机制。
　　方法：
　　1.采用ELISA技术，检测PBC患者（Child-Pugh A级组、Child-Pugh B级组、Child-Pugh C级组）血清中IL-33水平，观察IL-33表达水平与PBC患者肝损伤标志ALT、AST、ALP、GGT水平的相关性，阐明IL-33表达水平与疾病严重程度的关系。
　　2.利用肝脏组织原位免疫组化分析技术和RT-PCR技术，检测PBC患者不同组织学阶段的（早期组：相于I+Ⅱ期、晚期组：相当于Ⅲ+Ⅳ期)肝组织内IL-33 mRNA以及ST2 mRNA表达水平，观察IL-33+细胞在PBC患者不同组织学阶段的表达水平以及PBC患者肝脏中中性粒细胞（MPO+细胞）的数量与IL-33 mRNA水平相关性。
　　3.通过中性粒细胞趋化实验，明确PBC患者血浆中IL-33对中性粒细胞的作用效应。
　　结果：
　　1. PBC患者血清中的IL-33浓度升高
　　与健康对照组（HCs）血清中IL-33表达水平（32.24±8.37 pg/ml）相比，PBC患者血清中IL-33的浓度（69.44±10.70 pg/ml）显著升高（P<0.001）。此外我们对PBC患者进行Child-Pugh分级，发现：与Child-Pugh A级组PBC患者血清IL-33水平（57.24±6.55 pg/ml）相比，Child-Pugh B级组和Child-Pugh C级组的IL-33水平明显升高（74.93±6.56和75.61±7.95 pg/ml）（P<0.001）；而在Child-Pugh B级组和Child-Pugh C级组患者血清IL-33水平则未见明显差异（P>0.05）。
　　2. PBC患者血清中sST2的浓度升高
　　我们进一步检测了PBC患者血清中sST2的浓度，发现与健康对照组（HCs）血清中sST2表达水平（144.94±224.60 pg/ml）相比，PBC患者血清中sST2的浓度（70.47±25.81 pg/ml）显著升高（P<0.001）。而各Child-Pugh分级组的PBC患者血清sST2浓度无明显差异（Child-Pugh A级组，1343.84±583.28 pg/ml、Child-Pugh B级组，1438.31±485.42 pg/ml、Child-Pugh C级组，1439.37±503.73 pg/ml）（P>0.05）。3. PBC患者血清IL-33浓度与ALP水平相关
　　我们进一步对PBC患者血清IL-33水平与其肝生化学指标的相关性进行探讨，发现PBC患者血清IL-33浓度与ALP水平显著相关（R=0.421，P<0.001），而与ALT、AST及GGT水平无显著相关性（R=-0.023、R=-0.071、R=0.158，P值均>0.05）。4. IL-33+细胞增多与PBC患者的组织学分期密切相关
　　我们进一步对PBC患者肝组织内IL-33原位免疫组化分析发现，与HCs肝脏组织相比，PBC患者肝组织中IL-33+细胞数量显著增多（P<0.001）。此外，我们进一步探讨PBC患者肝组织中IL-33+细胞数量与PBC患者肝脏病理分期的相关性，发现，与PBCⅠ期和PBCⅡ期患者相比，PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝组织中IL-33+细胞浸润显著增多（P<0.001）。与此同时，我们发现IL-33 mRNA的表达水平在PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝组织中，较HCs、PBCⅠ期和PBCⅡ期患者肝组织中水平明显升高（P<0.001）。
　　5. PBC患者肝组织内中性粒细胞浸润增加且与其IL-33 mRNA表达水平密切相关
　　随后我们对PBC患者肝组织中中性粒细胞的浸润水平进行探讨，肝脏原位免疫组织化学发现髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）+细胞较HCs肝组织中显著增多（P<0.001）。我们进一步研究发现，与PBCⅠ期和PBCⅡ期患者相比，PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝组织中MPO+细胞浸润明显升高（P<0.001）。与此同时，我们还发现PBC患者肝组织中MPO+细胞的数量与其IL-33 mRNA表达水平密切相关（R=0.81，P<0.001）。
　　6.升高的IL-33促进了中性粒细胞的趋化作用
　　为了进一步确定IL-33对中性粒细胞的作用效应，我们进行了中性粒细胞趋化作用的分析。结果发现，与HCs患者的血浆相比，PBC患者的血浆可诱导更多的中性粒细胞迁移（P<0.001）。此外，与PBC患者血浆中培养的中性粒细胞相比，当把IL-33加回到PBC患者血浆时，其中性粒细胞的趋化指数可进一步升高（P<0.001）。
　　结论：
　　PBC患者的血清IL-33表达水平明显升高，同时肝组织内IL-33+细胞表达水平以及IL-33 mRNA的表达水平也明显升高，而且与PBC患者疾病进展相关；PBC患者肝组织内中性粒细胞浸润增多，且与IL-33 mRNA的表达水平相关，并随着PBC患者疾病进展浸润加重，提示中性粒细胞在PBC患者疾病进程中发挥重要作用；PBC患者的血清sST2表达水平明显升高，体外实验发现IL-33可增加PBC患者血浆对中性粒细胞的趋化作用，进一步提示IL-33可能通过IL-33/ST2募集中性粒细胞从血液中向肝组织内迁移进而加重PBC患者疾病进展。这些结果进一步证实，IL-33诱导的中性粒细胞迁移可能会成为PBC患者治疗的新靶点。为将来进一步研究原发性胆汁性肝硬化的发病机制，以及开发临床治疗新药物，提供了理论依据和参考。

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声明

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缩略语表

第一部分 实验研究IL-33通过向肝脏募集中性粒细胞促进原发性胆汁性肝硬化疾病进展

中文摘要

Abstract

前言

文献回顾

实验一 原发性胆汁性肝硬化血清IL-33的表达及与疾病进展相关性的研究

实验二 原发性胆汁性肝硬化肝组织IL-33及

实验三 体外IL-33的免疫调节功能研究

讨论

小结

第二部分 中医临床研究愈肝方联合熊去氧胆酸胶囊治疗原发性胆汁性肝硬化的临床研究

中文摘要

Abstract

前言

文献回顾

1. 研究目的

2. 资料与方法

3.研究结果

讨论

结论

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢