牙髓成纤维细胞NLRP3炎症体的表达、活化及作用机制研究

摘要

固有免疫系统是保护宿主免受病原体侵害的第一道屏障，可以借助种系编码的模式识别受体识别来自病原微生物的危险信号——病原体相关分子模式以及宿主自身来源的危险信号——危险相关分子模式。目前已发现的模式识别受体有四大类，包括TLRs、CLRs、RLRs以及NLRs。不同于其他模式识别受体，一部分NLRs的家族成员可以形成炎症体、调节caspase-1活性，后者影响IL-1β的成熟和分泌。NLRP3是目前研究最为深入和广泛的一种炎症体，在多种疾病的病理过程发挥非常重要的作用。
　　本研究组前期研究结果表明，NLRP3炎症体在人牙髓成纤维细胞（Human dental pulp fibroblasts，HDPFs）中表达，并且与牙髓固有免疫以及损伤修复具有非常密切的关系。但NLRP3炎症体在牙髓成纤维细胞中的作用如何？那些因素参与NLRP3表达的调控？其激活机制又是如何？这些问题目前尚不清楚。阐明这些问题有助于加深对牙髓组织固有免疫的理解，并为寻找牙髓炎症新的治疗方法奠定基础。
　　研究目的：
　　1.探讨NLRP3炎症体在HDPFs中的作用及作用机制
　　2.探讨牙HDPFs中NLRP3炎症体的激活机制
　　3.探讨HDPFs中NLRP3的转录调节机制
　　4.探讨HDPFs中NLRP3的转录后调节机制
　　方法：
　　1.用LPS和ATP刺激HDPFs，RT-PCR和western-blot检测NLRP3炎症体相关基因的表达水平，ELISA检测细胞外IL-1β浓度。通过构建shRNA慢病毒载体分别沉默NLRP3和caspase-1，观察两种基因对HDPFs细胞分泌IL-1β的影响。
　　2.利用荧光染料标记细胞内ROS和超氧化物，激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测ATP刺激对HDPFs中ROS水平的影响；利用ROS抑制剂阻断ROS的生成，western-blot和ELISA检测p20表达水平和IL-1β分泌水平，观察其对NLRP3炎症体活性的影响。
　　3.利用CLI-095、Pepinh-MYD和Bay11-7082分别抑制TLR4、MyD88和NF-κB，LPS刺激HDPFs，RT-PCR和western-blot检测NLRP3、caspase-1及IL-1β mRNA表达水平，ELISA检测细胞外IL-1β浓度。
　　4. RT-PCR检测LPS和ATP刺激时HDPFs中miR-223和miR-22表达水平；荧光素酶报告检测确认miR-223和miR-22与靶基因NLRP3的结合；转染miRNA mimics过表达miR-223和miR-22，western-blot和ELISA检测NLRP3炎症体活性。
　　结果：
　　1. LPS刺激引起NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表达水平升高；LPS和ATP共同刺激引起HDPFs释放IL-1β；沉默NLRP3和caspase-1均可抑制IL-1β的分泌，但对IL-1β mRNA表达水平无影响。
　　2. ATP刺激诱导HDPFs产生大量ROS；ROS抑制剂可抑制ATP刺激引起的p20的表达和IL-1β分泌。
　　3.抑制TLR4可显著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表达水平，而抑制 MyD88和NF-κB仅可抑制NLRP3和IL-1β mRNA表达水平，对caspase-1的表达无明显影响。
　　4. RT-PCR结果证明miR-223和miR-22在HDPFs中确有表达，LPS刺激导致二者表达水平下降，荧光素酶报告检测结果证实 miR-223和miR-22均可与NLRP33’UTR结合；过表达miR-223和miR-22会导致NLRP3蛋白表达水平下降，IL-1β分泌减少。
　　结论：
　　1. NLRP3炎症体对HDPFs细胞IL-1β的分泌起关键调节作用。
　　2. ATP激活NLRP3炎症体依赖细胞内ROS的产生。
　　3. TLR4-MyD88-NF-κB信号通路调节NLRP3的表达水平。
　　4. miR-223和miR-22可抑制NLRP3蛋白表达并降低NLRP3炎症体活性。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、炎症和模式识别受体

二、TOLL样受体家族及其信号转导通路概述

三、NOD样受体家族和炎症体概述

四、TLRs等信号通路对炎症体活性和IL-1β分泌的调节

五、MicroRNA对炎症及炎症体活性的调节

六、牙髓成纤维细胞在牙髓固有免疫应答中的作用

第一部分、牙髓成纤维细胞中NLRP3炎症体的表达及其对IL-1β 分泌的影响

实验一、LPS和ATP刺激时牙髓成纤维细胞中NLRP3炎症体及IL-1β表达水平的变化

实验二、NLRP3和Caspase-1 shRNA慢病毒载体的构建及相应基因沉默细胞系的建立

实验三、NLRP3和Caspase-1 基因沉默对HDPF分泌IL-1β的影响

第二部分、外源性ATP刺激对HDPF中ROS水平及NLRP3炎症体活性影响

实验一、ATP刺激时HDPF中ROS水平变化

实验二、ROS抑制剂对ATP激活NLRP3炎症体的影响

第三部分、TLR4、MyD88、NF-κB信号通路对HDPF中NLRP3炎症体表达的影响

1、材料

2、方法

3、结果

4、讨论

第四部分、miR223和miR22对HDPF中NLRP3炎症体表达的影响

实验一、miR223和miR22在HDPF中的表达及LPS对二者表达水平的影响

实验二、体外双荧光素酶报告系统检测miR223和miR22对NLRP3的调控

实验三、过表达miR223和miR22对HDPF中NLRP3表达及IL-1β分泌的调控

小结

参考文献

附录

一、shRNA-GV248重组慢病毒载体测序结果：

二、NLRP3 3’ UTR及3’ UTR MUT测序结果：

个人简历及研究成果

致谢