肿瘤细胞线粒体靶向递药系统的构建及其抗肿瘤活性研究

摘要

阿霉素（doxorubicin，DOX）是临床常用的广谱抗肿瘤药物之一，疗效确切、价格低廉。但是由于其心脏毒性及高的耐药率严重限制它的临床应用。研究发现DOX除了作用于细胞核DNA外，线粒体也是其重要靶点。如果将DOX特异地递送到肿瘤细胞的细胞核及线粒体，便可以提高其疗效、降低全身毒副作用。很多人类肿瘤细胞如黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等高表达 Sigma受体，茴香酰胺（AA）是Sigma受体的选择性配体。经AA修饰的递药系统具有肿瘤主动靶向功能。
　　目的：
　　本研究以 AA为肿瘤细胞特异性靶向配基，分别构建基于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）的酸敏胶束递药系统和基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的酸敏纳米粒递药系统，将DOX递送至肿瘤细胞线粒体，以期提高DOX的抗肿瘤活性、逆转肿瘤耐药、降低DOX的全身毒副功能。
　　方法：
　　以 DSPE、聚乙二醇（PEG）、对乙酰基苯甲酸、对甲氧基苯甲酰氯、胆固醇（CHOL）、三苯基溴化膦（triphenylphosphonium，TPP）、地喹氯铵（dequalinium，DQA）和DOX为原料，合成DOX线粒体靶向连接物DQA-DOX，以及AA-PEG-hyd-DSPE、AA-PEG-hyd-CHOL、TPP-CHOL等连接物，并通过质谱、红外与核磁对合成的连接物进行结构鉴定。采用乳化溶剂挥发法制备同时包封DOX和DQA-DOX的酸敏胶束DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、只包封 DOX的酸敏胶束 DOX@DSPE-hyd-PEG-AA，以及AA-PEG-hyd-CHOL与TPP-CHOL修饰的包封DOX的PLGA纳米粒LNPs，并对递药系统进行表征。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）观察 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及 LNPs的体外抗肿瘤活性。采用试剂盒法观察 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs诱导肿瘤细胞凋亡的作用。采用激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA和LNPs的摄取，以及DOX在肿瘤细胞内的分布情况。构建裸鼠荷瘤（MDA-MB-231/ADR细胞、A549细胞）模型，分别观察DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs的体内抗肿瘤活性，采用活体成像仪观察荷瘤裸鼠静脉注射给予 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs后，DOX在荷瘤裸鼠体内的分布。
　　结果：
　　1.经质谱、红外、1H NMR鉴定结果表明所合成的连接物均为目标产物。
　　2. DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA的粒径为224 nm，DOX和DQA-DOX的载药量分别为6.2％和6.5%。DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA的体外释药具有pH依赖性：在pH5.0的缓冲液中，96 h内DOX和DQA-DOX的累积释放百分率分别为90%和80%。体外抗肿瘤活性结果表明，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA可以浓度依赖性地抑制肿瘤细胞生长。在DOX浓度为50μmol/L，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA处理A549细胞与MDA-MB-231/ADR细胞48 h后，细胞存活率分别为24%和34%。激光共聚焦显微镜观察表明，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA进入细胞后，DOX首先分布于肿瘤细胞溶酶体，最终进入到线粒体。相同DOX浓度条件下，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA可以将进入细胞内DOX量的80%递送到A549细胞的线粒体，进入细胞内DOX量的75%递送到MDA-MB-231/ADR细胞的线粒体。当DOX剂量为10μmol/kg时，游离DOX和DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA对裸鼠移植瘤（MDA-MB-231/ADR细胞）的抑瘤率分别为22%和77%。与游离DOX组相比，DOX/DQA-DOX@DSPE- hyd-PEG-AA给药后DOX主要分布于肿瘤组织，少量分布在肝脏与心脏；HE染色结果表明，游离DOX给药后，荷瘤裸鼠心肌组织形态变化明显；DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA给药后，荷瘤裸鼠心肌组织形态未见明显变化。
　　3. LNPs的粒径和载药量分别为188 nm和5.4%。LNPs的体外释药具有pH依赖特性。体外抗肿瘤活性结果表明，LNPs可以浓度依赖性地抑制肿瘤细胞生长。在DOX浓度为50μmol/L，LNPs处理A549细胞与MDA-MB-231/ADR细胞48 h后，细胞存活率分别为19%和29%。激光共聚焦显微镜观察表明，LNPs进入细胞后，DOX首先分布于肿瘤细胞溶酶体，最终进入到线粒体。相同DOX浓度条件下，LNPs可以将进入细胞内DOX量的81%递送到A549细胞的线粒体，进入细胞内DOX量的87%递送到MDA-MB-231/ADR细胞的线粒体。当DOX剂量为10μmol/kg时，游离DOX和LNPs对裸鼠移植瘤（A549细胞）的抑瘤率分别为53%和80%。LNPs给药组 DOX主要分布于肿瘤组织，少量分布在肾脏。HE染色结果表明，游离 DOX给药后，荷瘤裸鼠心肌组织形态变化明显；LNPs给药后，荷瘤裸鼠心肌组织形态未见明显变化。
　　结论：
　　DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及 LNPs的体外释药具有酸敏特性。DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs可将DOX运送至肿瘤细胞的线粒体；提高了DOX在肿瘤细胞的蓄积，增强了DOX的抗肿瘤活性，可逆转肿瘤耐药，降低了DOX的全身毒副作用。

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缩略词表

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前言

文献回顾

1 肿瘤靶向阿霉素递药系统研究进展

2 肿瘤细胞线粒体靶向递药系统研究进展

3 肿瘤靶向药物递送机制

第一部分 基于DSPE酸敏胶束的肿瘤细胞线粒体靶向递药系统研究

实验一 嵌段材料的合成及表征

1 材料

2 方法

3 结构表征

4 讨论

实验二 基于DSPE酸敏胶束的制备及其抗肿瘤活性研究

1 材料

2 方法

3 实验结果与讨论

4 讨论

第二部分 基于PLGA的肿瘤细胞线粒体靶向递药系统的研究

实验一 嵌段材料的合成及表征

1 材料

2 方法

3 结构表征

4 讨论

实验二 脂质修饰PLGA纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

1 材料

2 方法步骤

3 实验结果与讨论

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢