LAMP-2在原发性胆汁性肝硬化中的临床意义及其参与胆汁排泄的机制探讨

摘要

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种慢性进行性肝内胆汁淤积性肝病，最终可发展为肝纤维化和肝硬化。PBC在世界各地均有分布，各年龄段均可发病，尤其好发于中年女性。西方国家报道的发病率较高。近年来，由于对PBC认识程度和疾病诊断水平的提高，我国报道的PBC病例数也呈大幅度上升趋势。
　　熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）批准的目前可用于PBC治疗的唯一药物。研究发现长期使用UDCA可有效改善患者的各项指标，延缓疾病进展，减少肝硬化发生，降低肝移植需求率，提高患者的生存率。但仍有约1/3的患者对UDCA不应答，<40岁的PBC患者不应答率甚至超过50％。因此，早期发现那些UDCA不应答或部分应答的PBC患者具有重要的临床意义。
　　溶酶体相关膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein2，LAMP-2）是我们率先发现的PBC相关分子，前期研究发现LAMP-2对PBC病理诊断具有重要意义，且其在PBC肝脏组织中的表达与疾病病理分期正相关。但LAMP-2分子的确切功能尚待深入研究，尤其是其在PBC等胆汁淤积性疾病中的作用目前还不清楚。
　　本研究共分三部分：1）鉴于肝穿病理检查的局限性和有创性，从血清学角度出发，利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测PBC患者血清中的 LAMP-2含量，进一步结合患者临床相关指标的变化，分析血清LAMP-2在PBC临床中的意义，尤其是其对PBC患者UDCA生化应答的评估价值。2）为了深入了解LAMP-2分子在PBC等胆汁淤积性疾病中的作用，借助转录激活因子样效应核酸酶技术（transcription activator-like effector nucleases，TALENs），构建LAMP-2基因敲除大鼠模型，并对该模型鼠的胆汁淤积表型进行鉴定。3）以所建的LAMP-2基因敲除大鼠模型为工具，探讨LAMP-2与肝细胞胆汁淤积的关系，以及LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。
　　第一部分应用血清LAMP-2评价PBC患者UDCA应答的临床研究
　　目的：
　　UDCA是美国FDA批准的目前可用于PBC治疗的唯一药物。研究发现长期使用UDCA可有效改善患者的各项指标，延缓疾病进展，减少肝硬化发生，降低肝移植需求率，提高患者的生存率，但仍有约1/3的患者对UDCA不应答。我们前期研究发现LAMP-2在PBC患者肝脏组织中的表达与患者疾病病理分期正相关。本研究拟在前期研究基础上探讨PBC患者血清LAMP-2水平与疾病进展之间的关系，尤其是血清LAMP-2在评估患者UDCA生化应答方面的价值。
　　方法：
　　该回顾性研究纳入了自2007年至2013年就诊于我院（第四军医大学，西京消化病医院）的新诊断 PBC患者102例。所有患者均接受 UDCA治疗，治疗剂量为13~15 mg/kg/day。采集患者治疗前和治疗后1、3、6和12个月时的全血标本，收集血清。同时收集相应时间点的随访资料，其中包括肝穿病理检查结果和临床相关检测指标，如总胆红素、ALP、GGT、AST、ALT、ALB和IgM等。研究同时纳入了经由我院诊断的乙肝患者126例、丙肝患者114例，肝内胆汁淤积患者（包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、药物性肝病、Gilbert's病和Dubin-Johnson综合征）27例，以及未发现明显异常的健康对照者84例。各对照组年龄和性别均与PBC患者保持组内平衡。所有对照者均收集有治疗前的血清标本，以及相应时间点的随访资料。利用ELISA方法检测PBC患者及对照者血清中的LAMP-2含量，进一步分析血清LAMP-2在PBC临床中的意义。
　　结果：
　　1）治疗前PBC患者血清 LAMP-2水平明显高于乙肝患者、丙肝患者、肝内胆汁淤积患者以及健康对照者。
　　2）治疗前不同PBC亚群患者血清LAMP-2水平不同，其中以晚期患者（III-IV期）和胆红素>1mg/dL的患者血清LAMP-2升高最明显。
　　3）治疗前PBC患者血清LAMP-2水平不能独立反映UDCA疗效。
　　4）PBC患者接受UDCA治疗后，血清LAMP-2降低趋势与肝脏相关指标的变化趋势一致，并在UDCA治疗3个月时降低即很明显。
　　5）PBC患者接受UDCA治疗后，应答患者血清LAMP-2降低更明显。
　　6） UDCA治疗3个月时，PBC患者血清LAMP-2下降有助于患者UDCA应答的判读。
　　结论：
　　PBC患者接受 UDCA治疗3个月时，血清 LAMP-2的下降有助于评判患者对UDCA的应答。
　　第二和三部分 LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的机制研究
　　目的：
　　LAMP-2分子在多种生物学进程中发挥重要作用，但该分子的确切功能尚待深入探讨。我们前期研究发现，PBC患者肝脏组织中LAMP-2表达与患者疾病进展密切相关，血清LAMP-2变化对评判PBC患者UDCA生化应答具有重要价值。本部分的研究目的在于探讨LAMP-2在胆汁淤积性疾病中的作用，以及LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。
　　方法：
　　利用TALENs技术构建LAMP-2基因敲除大鼠模型，并以建立的基因敲除大鼠模型为工具，通过体内研究探讨 LAMP-2与肝细胞胆汁淤积的关系，以及 LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。体外构建LAMP-2过表达及LAMP-2 RNAi干扰细胞模型，并以所建细胞模型为工具，对体内研究结果进行验证。
　　结果：
　　借助TALENs技术，成功构建了LAMP-2基因敲除大鼠模型。进一步研究发现：
　　1）LAMP-2基因敲除大鼠肝脏表现有胆汁淤积的现象。
　　2）LAMP-2基因敲除大鼠对胆汁淤积的耐受性降低，更易发生胆汁排泄障碍。
　　3）相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）差异分析结果显示，LAMP-2基因敲除大鼠肝细胞毛细胆管膜转运体异常改变。
　　4）LAMP-2基因敲除大鼠肝脏毛细胆管膜上与胆汁排泄直接相关的重要转运体多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，Mrp2）表达异常。
　　5）LAMP-2基因敲除大鼠的体内实验发现，LAMP-2通过调控 Mrp2在肝细胞毛细胆管膜上的定位，影响肝细胞胆汁排泄过程。
　　6）体外细胞学实验支持：LAMP-2参与调控MRP2在肝细胞毛细胆管膜上的定位，进而可能参与肝细胞毛细胆管膜的形成，从而影响肝细胞胆汁排泄过程。
　　结论：
　　LAMP-2分子通过调控Mrp2/MRP2分子在肝细胞毛细胆管膜上的定位，参与影响肝细胞毛细胆管膜的形成，最终影响肝细胞的胆汁排泄能力。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、原发性胆汁性肝硬化的研究现状和发病机制

二、肝脏胆汁生成的解剖学基础和肝细胞毛细胆管膜胆汁排泄的分子机制

三、PBC研究之新分子：mAb1F9-Ag/溶酶体相关膜蛋白2

第一部分 应用血清LAMP-2评价PBC患者UDCA应答的临床研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 LAMP-2参与胆汁排泄的表型鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 LAMP-2参与胆汁排泄的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

一、PBC患者接受UDCA治疗3个月时，血清LAMP-2的下降有助于评判患者对UDCA的应答。

二、LAMP-2分子通过调控MRP2/Mrp2分子在肝细胞毛细胆管膜上的定位，影响肝细胞毛细胆管膜的形成，最终影响肝细胞的胆汁排泄能力。

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢