CD147-AnnexinA2相互作用调控肿瘤细胞运动的分子机制研究

摘要

侵袭和转移是肿瘤的主要特征，也是恶性肿瘤致死的主要原因。细胞运动在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用，细胞运动调控的分子机制研究一直是肿瘤生物学研究的热点。研究发现CD147和Annexin A2都参与了肿瘤细胞肌动蛋白骨架重排，是调控肿瘤细胞运动的重要分子。前期的工作发现CD147通过调控Annexin A2活化的 RhoA信号通路参与了肝癌细胞运动的调控，在此基础上本课题进行了进一步的探讨。
　　本课题主要包括三个部分：
　　第一部分CD147与Annexin A2相互作用的研究。
　　应用免疫共沉淀和质谱联用的方法，发现Annexin A2是CD147可能的互作分子。基于激光共聚焦的共定位分析显示CD147和Annexin A2在肝癌和肺癌细胞中有很好的共定位。接着采用荧光共振能量转移实验（FRET）证实 CD147和Annexin A2在活细胞中存在直接的相互作用。表达并纯化了CD147胞外段蛋白和Annexin A2蛋白，采用表面等离子共振技术（SPR）测定了CD147和Annexin A2相互作用的动力学参数。然后，将CD147截短表达，采用His Pull-Down、FRET、SPR等方法明确了CD147胞外段能与Annexin A2相互作用。
　　第二部分CD147调控Annexin A2磷酸化的分子机制研究。
　　首先检测了Src、CD147对Annexin A2酪氨酸磷酸化的影响，发现Src激酶能磷酸化Annexin A2，而CD147能负向调控Annexin A2的酪氨酸磷酸化，这与之前的报道一致。同时过表达Src和CD147，发现CD147能抑制Src对Annexin A2的磷酸化。体外激酶实验证实，CD147胞外段蛋白和I结构域蛋白能够抑制Src对Annexin A2的磷酸化，而C2结构域蛋白则不能抑制Src对Annexin A2的磷酸化。据此，采用FRET实验进一步分析了C2结构域和I结构域与Annexin A2 N端结构域的结合情况，发现只有I结构域能够结合Annexin A2的N端结构域，这就提示CD147通过其I结构域与Annexin A2的N端结构域相互作用从而抑制了Src对Annexin A2的磷酸化。
　　第三部分p-Annexin A2调控肿瘤细胞运动的分子机制研究。
　　检测了CD147和Annexin A2对肿瘤细胞运动的影响，发现CD147能够通过调控Annexin A2的酪氨酸磷酸化进而调控肿瘤细胞运动，然而其具体机制仍不明确。通过下调Annexin A2表达后检测DOCK家族GEF的mRNA表达水平，发现DOCK3表达水平显著降低。通过下调细胞内源性Annexin A2后回复表达野生型Annexin A2、Annexin A2的磷酸化位点突变体，发现DOCK3表达水平受Annexin A2磷酸化水平的调控。这提示p-Annexin A2可能通过DOCK3调控肿瘤细胞运动。通过检测Rac1、RhoA的活性及下游效应分子的表达水平，发现DOCK3是Rac1的GEF，而WAVE2的表达水平与DOCK3呈负相关，且下调DOCK3后细胞的片状伪足形成显著增多。进一步研究证实 DOCK3能够通过负向调控β-catenin信号通路进而抑制 WAVE2的表达。应用 CD147敲除的肝癌、结肠癌细胞系以及CD147稳定干涉的肺癌细胞系，证实了CD147通过 p-Annexin A2/DOCK3/β-catenin/WAVE2信号轴调控片状伪足形成和肿瘤细胞运动。最后建立了裸鼠脾脏注射转移模型，结果表明CD147能够促进肝癌转移，这提示CD147促进肿瘤细胞运动可能是其调控肝癌转移的关键分子机制之一。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、细胞运动在肿瘤转移中发挥重要作用

二、细胞突起是细胞运动的重要结构基础

三、Rho家族小G蛋白是细胞运动的主要调控分子

四、WAVE2调控细胞骨架重排并与肿瘤预后密切相关

五、DOCK家族GEFs在肿瘤细胞运动调控中发挥重要作用

六、CD147在肿瘤细胞运动过程中发挥重要作用

七、Annexin A2参与肿瘤细胞运动调控

第一部分 CD147与Annexin A2的相互作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 CD147调控Annexin A2磷酸化的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 p-Annexin A2调控肿瘤细胞运动的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢