人脐静脉内皮细胞内化骨髓间充质干细胞源膜微囊的途径探索

摘要

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）由于其较强的再生能力，免疫调节功能及多向分化的潜能被广泛应用于再生医学中，同时为缺血性心肌病的治疗带来了新的希望。然而，其具体的作用机制仍不清楚。近期大量的动物实验发现体外培养的MSC进入体内后，绝大多数细胞由于体内存在的排斥反应和不适应机体内缺血缺氧的微环境在72小时内死亡，但是能显著改善心功能。那么，死亡的MSC是如何发挥作用的呢？我们的前期研究表明，MSC在低氧低营养的条件下可释放大量膜微囊(microvesicles，MVs)，而且MV体外可内化入内皮细胞并促进其增殖、迁移和管状结构形成，体内也能促进缺血肢体血管新生。因此，至少在促进血管新生方面，MV可能是MSC发挥作用的主要介质。在上述过程中，内皮细胞内化MV是关键的步骤。然而，MSC来源的MV(MSC-MV)通过何种途径进入内皮细胞，至今未见系统的报告。
　　实验目的：
　　膜微囊是细胞在激活或凋亡过程中释放的一种囊泡结构，其可携带母细胞的遗传信息传递给靶细胞，被认为是细胞间信息传递的重要介质。通过对其内化机制的研究可以为干细胞的临床治疗机制和膜微囊替代干细胞治疗提供一定的理论基础。
　　实验方法：
　　1.利用密度梯度离心及差速贴壁的方法，分离纯化人骨髓MSC（BMSC），并通过形态观察、体外成骨和成脂肪能力以及细胞表型，对BMSC进行鉴定。
　　2.经鉴定后的BMSC，在1％氧及无血清条件下诱导其凋亡，获取细胞培养上清，经超速离心分离得到BMSC-MV，并通过电镜对其形态进行鉴定，流式细胞术检测MV表面标志物的表达，以确定BMSC-MV的来源及其基本特征。同时，用CFSE或DiI荧光染料对BMSC-MV进行标记观察BMSC-MV内化，。
　　3.以人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）为对象，用抗人的CD29和CD44抗体，和/或重组人膜联蛋白V（Anx-V）预处理后的BMSC-MV后与HUVEC共培养，流式细胞术和共聚焦显微术评价BMSC-MV内化情况。此外，利用干扰RNA（siRNA）转染HUVEC，以特异抑制 Anx-V和磷脂酰丝氨酸受体（PSR）表达，进一步观察BMSC-MV内化的改变。
　　结果：
　　1.成功分离BMSC，并在特定诱导条件下，可分化为成骨细胞及成脂细胞。流式细胞术检测示其表面高表达CD73，CD44，不表达CD45和CD31。
　　2.成功分离获取BMSC-MV，并通过流式检测证明其表面高表达与BMSC相同的表面分子CD73，CD44，不表达CD45和CD31。同时高表达CD29，磷脂酰丝氨酸（PS）。
　　3.HUVEC可内化BMSC-MV，并存在一定的时间及浓度依赖性效应，通过CD29，CD44抗体及外源性重组人Anx-V可以封闭BMSC-MV表面的相应的分子CD29，CD44，PS抑制其内化。siRNA干扰HUVEC表面的Anx-V后，BMSC-MV内化未见明显变化；干扰PSR合成后BMSC-MV的内化显著减少。
　　结论：
　　（1）在低氧低营养的条件下，人骨髓间充质干细胞可释放大量的膜微囊。
　　（2）人脐带静脉内皮细胞可内化人骨髓间充质干细胞来源的膜微囊，且该过程呈现明显的时间及浓度依赖效应。
　　（3）膜微囊表面的CD29，CD44，PS均参与了其内化过程。
　　（4）膜微囊表面磷脂酰丝氨酸与内皮细胞表面磷脂酰丝氨酸受体的特异性结合，是人脐带静脉内皮细胞内化膜微囊的关键分子途径。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、冠状动脉硬化性心脏病

二、间充质干细胞在缺血性心脏病中的治疗进展

三、膜微囊简介

四、膜微囊与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系

五、间充质干细胞源膜微囊在缺血性心脏病中的作用

六、膜微囊的内化

第一部分 人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 膜微囊的获取鉴定及内化的观察

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

第三部分 HUVEC内化BMSC-MV的途径研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢