间充质干细胞通过调控枯否细胞M1型和M2型改善肝纤维化的实验研究

摘要

肝硬化是由各种因素引起慢性肝脏损害并发展至晚期阶段的一类疾病，其发病率和死亡率均呈逐年增高的趋势，在全世界范围内，每年由肝硬化导致的死亡人数多达103万，肝硬化已在最常见的死亡病因中位列第14位[1]，严重危害着人类的健康。目前采用内科常规的保肝和对症治疗难以获得良好疗效，其有效手段仍然是原位肝移植，但是由于供肝缺乏、花费巨大等因素极大地限制了肝移植的临床应用。因此，明确肝纤维化的发病机制，在早期进行预防和逆转肝纤维化至关重要。
　　近年来，间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）被发现不仅具有自我更新、多向分化等潜能，其免疫调节作用也越来越受到临床各个领域研究者的重视。研究发现 MSCs可免疫调节慢性肝纤维化的炎症，能够明显改善肝功，延长终末期肝病患者的生存期，这为肝脏组织损伤修复和细胞治疗带来了切入点和新希望。
　　肝脏中有一类重要的非实质免疫细胞，即枯否细胞（Kupffer cells，KCs），它是机体内一道重要防线，在维持肝脏内环境的稳态中发挥着关键作用。现有研究报道枯否细胞有两种不同的激活途径，分别产生两种不同类型的 KCs，即 M1型和M2型。这两型细胞之间的平衡与肿瘤、感染及组织损伤等炎症性疾病密切相关。
　　本课题组前期对MSCs调节KCs的研究进行了探索。研究发现：将含有磷酸二钠脂质体的溶液经尾静脉注射给肝纤维化小鼠（CCl4肝损伤模型），用于剔除 KCs后，给予小鼠MSCs治疗，结果发现未剔除KCs组的肝纤维化小鼠治疗效果明显优于剔除KCs的治疗组。进一步研究表明，未剔除KCs组的小鼠肝内M2型KCs相关因子CD206、Arg-1、IL-10的mRNA表达明显升高，而M1型相关的CD68、TNF-α的mRNA表达降低。提示，肝脏KCs参与了MSCs治疗肝纤维化的过程，可能通过诱导 M2型肝脏KCs的激活来减轻肝纤维化。
　　本研究是在前期探索性研究的基础上，仍采用经典的CCl4腹腔注射法诱导肝纤维化小鼠模型，并对肝纤维化小鼠进行同源MSCs移植治疗，评价MSCs移植后的治疗效果，并主要探讨MSCs通过促进KCs类型转换治疗肝纤维化的机制，以期为临床应用MSCs治疗肝纤维化提供新的理论研究依据。
　　【目的】
　　1.明确CCl4诱导小鼠肝损伤不同阶段KCs亚群M1/M2的比例变化；
　　2.阐明MSCs是否通过调控KCs亚群M1/M2的比率而参与肝损伤修复。
　　【方法】
　　1.利用CCl4腹腔注射8周以诱导小鼠肝损伤模型。在肝纤维化造模的第2、4、6、8w分别收集小鼠血清、采取小鼠肝脏，前者用全自动生化分析仪检测小鼠血清中转氨酶AST、ALT及白蛋白ALB的水平；后者首先利用H&E染色方法观察模型小鼠的肝脏炎症，以及采用天狼星红染色方法量化分析肝纤维化程度，然后将肝脏组织连续切片，分别单标CD68和CD206进行免疫组化染色，观察两型KCs在肝损伤不同时间段的变化；
　　2.采用原位胶原酶灌注法分离小鼠肝损伤不同时间段(2、4、6、8w)的肝非实质细胞，经备皮、开腹、插管后进行原位灌注，离心后得到肝非实质细胞，再将CD68和CD206作为双标进行染色，用流式细胞仪检测M1和M2在肝损伤不同时间段的百分比；
　　3.采用全骨髓贴壁培养法分离、培养MSCs，在倒置显微镜和浮雕显微镜下观察细胞形态以及当MSCs生长至第三代时利用流式细胞仪检测细胞表面标记物进行鉴定；
　　4.将CCl4诱导的肝纤维化小鼠随机分为三组，分别是橄榄油对照组、未治疗组和治疗组。将同品系小鼠 MSCs经尾静脉移植给治疗组（1x106cells/mice）。同样通过血清学检测小鼠肝功能水平（AST、ALT、ALB），H&E和天狼星红染色检测肝组织炎症和纤维化程度；采用胶原酶灌注法分离小鼠肝非实质细胞，通过双标进行检测MSCs治疗后的两型KCs的百分比水平；
　　5.采用Real-time PCR方法测肝损伤以及MSCs治疗后，不同时间段内肝脏M1型（TNF-α、MCP1、IFN-γ）和M2型（Arg1、CD163、IL-10）相关因子表达水平。
　　【结果】
　　1.腹腔注射CCl4第8w时，H&E染色和天狼星红染色观察到小鼠肝脏组织出现大量炎性细胞浸润、形成显著的纤维化。血生化检测结果显示，转氨酶水平增高而白蛋白水平显著降低，提示小鼠肝纤维化模型建立成功。
　　2.免疫组织化学染色和流式细胞术检测结果表明，在CCl4诱导小鼠肝损伤过程中，CD68标记的M1型KCs逐渐升高，在第8w时表达明显增强，达到高峰。CD206标记的M2型KCs从第4w后逐渐升高，在第6w达到高峰，而后逐渐降低。Real-time PCR检测结果显示，肝脏组织中M1型相关因子（TNF-α、MCP1、IFN-γ）从第2w逐渐增高，到第8w时表达最高，而 M2型相关因子（Arg1、CD163、IL-10）从第4w逐渐升高，在第6w达到高峰，随后逐渐降低。提示：在CCl4诱导小鼠肝损伤的不同阶段中，M1和M2型KCs的比例发生了变化。
　　3.对CCl4诱导的肝纤维化小鼠给予同源MSCs移植后，MSCs移植组的治疗效果明显优于其他组，主要表现在小鼠肝组织损伤程度改善（可见H&E染色和天狼星红染色），以及血清转氨酶水平降低而白蛋白水平增高（可见血生化检测）。
　　4.对CCl4诱导的肝纤维化小鼠进行MSCs移植后，免疫组织化学染色和流式细胞术结果表明，MSCs移植组中CD68标记的M1型KCs表达降低，CD206标记的M2型KCs表达增高。同时，Real-time PCR检测结果显示，肝脏KCs的M1型相关因子（TNF-α、IFN-γ）表达水平降低，而M2型相关因子（CD163、IL-10）表达水平增高。提示：MSCs可能通过促进枯否细胞M1型向M2转换而参与肝损伤修复。
　　【结论】
　　本研究发现：(1) KCs参与了CCl4诱导肝纤维化小鼠的病理损伤过程，在炎症早期的KCs可能以M1型促炎为主，炎症中晚期以M2型抗炎为主。当M1/M2型细胞比率失衡，可能导致炎症加重，造成肝损伤后恢复不良；(2)在CCl4诱导的肝纤维化小鼠病理损伤过程中，MSCs可能通过诱导KCs的M1型向M2型转换，降低促炎因子表达而增加抗炎因子分泌，从而发挥其促进小鼠肝损伤修复的作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、肝硬化在国内、国外的发病及治疗现状

二、肝纤维化发病机制的研究现状

三、MSCs在纤维化中的研究现状

四、KCs与HSCs的关系

五、MSCs与KCs的关系

第一部分 明确CCl4诱导小鼠肝损伤不同阶段KCs亚群M1/M2的比例变化

1 材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 阐明MSCs是否通过调控KCs亚群M1/M2的比率而参与肝损伤修复

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢