壳聚糖海绵复合脂肪干细胞膜片对2型糖尿病大鼠颅骨极限骨缺损愈合促进作用的研究

摘要

随着口腔种植技术的进步与创新，T2DM已是种植非禁忌证，但是T2DM患者的种植失败率仍明显高于正常患者。在临床工作中，糖尿病患者拔牙后拔牙窝常可见骨愈合不良，即使植入常规骨替代材料后其骨愈合效果往往也并不理想。因此，研究适合 T2DM患者的骨替代材料具有非常重要的意义。ASCs是近些年来的研究热点，对骨缺损修复同样具有革命性意义，是骨组织工程中的干细胞理想来源。因此我们提出，采用ASCs构建的生物材料对T2DM状态下的骨形成具有重要的促进作用。在评价生物材料成骨效应之前，首先应当建立的是标准的CSD模型，遗憾的是如今国内外对于CSD模型的研究主要集中于正常动物模型，对于T2DM状态下CSD的大小尚属未知，这势必影响评价骨修复材料在T2DM状态下的生物活性的可信度。
　　基于此，本研究分为两个部分，首先，通过构建T2DM大鼠及正常大鼠颅骨系列骨缺损模型，探索 T2DM状态下大鼠颅骨 CSD值；其次，以壳聚糖海绵为支架，与ASCs膜片复合后植入T2DM大鼠颅骨CSD模型，观察壳聚糖海绵复合ASCs膜片对T2DM大鼠颅骨CSD模型骨愈合的促进作用。
　　第一部分T2DM大鼠颅骨CSD模型的实验研究
　　目的：探索T2DM大鼠颅骨CSD值的大小。
　　方法：选择SPF级9周龄SD大鼠，体重300-320 g，用高脂高糖饲料＋小剂量STZ腹腔注射诱导T2DM大鼠模型，建模成功后，将T2DM大鼠及正常大鼠各随机分为4组，每组3只，分别于颅骨中央区制备直径为2、3、4、5 mm，穿透颅骨到达硬脑膜的骨缺损；术后8周取材，分别行大体观察、X线检查及组织学染色。
　　结果：T2DM大鼠行颅骨缺损术后8周，直径2 mm的颅骨缺损愈合完全，X线阻射，组织学检测可见新骨生成良好；直径3、4、5 mm的颅骨缺损愈合不完整，X线透射，新骨生成不足。正常大鼠直径2、3、4 mm的缺损愈合完全，X线阻射，组织学检测可见新骨生成良好；直径5 mm的缺损未见愈合，X线透射，新骨生成较少。
　　结论：T2DM大鼠的颅骨骨缺损区愈合明显差于正常大鼠；T2DM大鼠颅骨CSD参考直径可定义为3 mm。
　　第二部分壳聚糖海绵复合ASCs膜片对T2DM大鼠颅骨CSD愈合促进作用的实验研究
　　目的：观察壳聚糖复合ASCs膜片能否促进T2DM大鼠颅骨CSD的愈合。
　　方法：体外分离培养大鼠原代ASCs细胞，通过BCIP/NBT染色、天狼星红染色、茜素红染色观察ASCs的成骨能力，油红O染色观察ASCs的成脂能力；使用冷冻干燥机制备壳聚糖海绵；诱导ASCs成膜后与支架海绵复合，通过DAPI染色、SEM观察壳聚糖海绵携带ASCs的能力；天狼星红染色观察ASCs膜片成胶原能力；并将壳聚糖复合ASCs膜片植入到T2DM大鼠颅骨CSD骨缺损区，对照组仅制备缺损不移植任何材料，实验组及对照组大鼠各5只。8周后取材，通过大体观察、Micro CT扫描、组织学染色观察壳聚糖复合ASCs膜片对于T2DM大鼠颅骨CSD愈合的促进情况。
　　结果：ASCs具有成骨、成脂多向分化能力；壳聚糖海绵能够很好的携带ASCs；ASCs膜片中含有大量的胶原；壳聚糖海绵复合ASCs膜片植入到颅骨CSD区后，T2DM大鼠颅骨 CSD区的骨愈合能力明显优于空白对照组。
　　结论：壳聚糖海绵复合ASCs膜片能够很好的促进T2DM大鼠颅骨CSD的骨愈合。

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前言

文献回顾

1．糖尿病及其对骨组织的影响

2. CSD及其研究现状

3. 壳聚糖在促进骨再生领域中的应用

4. ASCs在骨组织工程中的研究进展

第一部分 T2DM大鼠颅骨CSD的实验研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 壳聚糖海绵复合ASCs膜片对T2DM大鼠颅骨CSD愈合促进作用的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

研究成果

致谢