血小板衍生生长因子C在高转移性乳腺癌中的转录后调控机制研究

摘要

血小板衍生因子C（PDGF-C）属于血小板衍生因子（PDGF）家族的一员。在正常细胞中PDGF-C仅有少量表达，而在癌症组织中，PDGF-C表达增加，且与肿瘤的增殖、转移密切相关。PDGF-C可介导细胞发生多种生物学行为，一般通过结合其受体PDGFα或β发挥生物学功能，有研究表明PDGF-C可以促进新生血管的形成，可促使肿瘤细胞发生转移和增殖。PDGF-C还是一类被大家所认可的可以激活成纤维细胞的细胞因子。在乳腺癌中，肿瘤组织中表达有大量的PDGF-C，且其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关，而微环境中成纤维细胞上表达有PDGF-C的受体PDGFα和β，PDGF-C通过与其受体结合，激活受体，活化的受体导致酪氨酸激酶通路激活，介导成纤维细胞活化，参与多种细胞因子的分泌和细胞微环境的形成。
　　越来越多的研究者认为肿瘤的增殖、转移及侵袭不仅取决于肿瘤细胞本身，而且取决于其所生长的微环境。肿瘤微环境由肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞及细胞外基质等构成。在乳腺癌中，高转移性乳腺癌患者基质组织中存在大量的活化的成纤维细胞，又称癌相关的成纤维细胞（CAFs）。作为肿瘤微环境的重要组成部分，CAFs与乳腺癌的进展息息相关，CAFs可以分泌多种因子介导乳腺癌的发生、发展，促进乳腺癌的浸润、增殖和转移。研究者们广泛认同的如SDF-1/CXCR4（基质细胞衍生因子1/基质细胞衍生因子受体4）生物轴，SDF-1/CXCR4是CAFs分泌的重要因子，CAFs通过分泌SDF-1/CXCR4促进肿瘤的定向转移和血管的生成。CAFs还可以通过分泌其他因子来促进肿瘤的增殖和转移，如肝细胞生长因子的（HGF），表皮生长因子（EGF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），胰岛素样生长因子（IGF）等。CAFs是正常的成纤维细胞经过一些特定的细胞因子的刺激，使之成为活化的成纤维细胞（CAFs）。因此阻断肿瘤微环境中CAFs的活化过程能阻断肿瘤的发展过程。PDGF-C通过与其受体结合介导成纤维细胞的活化，因此降低PDGF-C的表达也可阻止成纤维细胞的活化。
　　基因序列编码的蛋白最终得以表达需通过转录和翻译等过程。由于转录和翻译的复杂性，使人类的基因表达调控系统也在多个层面异常复杂。其中基因表达调控非常重要的一个环节就是转录后水平的调节。转录后水平调节的最重要的调节点之一就是mRNA的稳定性。HuR是研究的最为成熟的一种RNA结合蛋白，分布于与多种组织中，包括乳腺、脾脏等，HuR通过于mRNA3’UTR区的AU富集元件结合激活其功能，增强mRNA的稳定性。根据本实验组前期的研究发现在高转移性乳腺癌中表达有大量的HuR，而低转移性乳腺癌中HuR的表达水平较低，文献也有类似的报道。我们通过生物信息学分析发现在PDGF-C mRNA的3’UTR区存在5个AU富集元件，可能是HuR的结合位点。构建PDGF-C mRNA的3’UTR区载体，转染入HuR高表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，双荧光素酶基因报告系统检测发现HuR可明显的增加荧光素酶基因的表达，且在第2个和第4个结合位点基因表达增长较明显，由此可知HuR可作用于PDGF-C mRNA的3’UTR区调节PDGFC。在MDA-MB-231细胞中，通过siRNA降低HuR的表达，用western blot技术检测在HuR不同表达水平下PDGF-C表达水平的变化，研究发现利用siRNA降低HuR的表达后，PDGF-C的表达也降低。说明HuR可以调节PDGF-C的表达，且为正向调节。
　　微小RNA（miR）也是通过转录后水平调节来调节蛋白的表达。miR是一类小的非编码RNA分子，贯穿癌症的整个发生、发展过程，多与原癌基因或抑癌基因相关。miR一般通过结合靶基因mRNA的3’UTR区，降解靶基因的mRNA，从而降低靶基因编码蛋白的表达。本研究通过生物信息学分析找出可能作用于PDGF-C mRNA的3’UTR区的miR，通过与PDGF-C mRNA的3’UTR的荧光载体共同转染入MDA-MB-231细胞中，培养48小时后，双荧光素酶基因报告系统验证有生物学功能的miR，研究发现在分析软件分析出的17种miR只有miR-382-5p降低读数最明显；将miR-382-5p类似物转染入MDA-MB-231细胞中，用western blot技术检测PDGF-C的表达变化，结果发现MDA-MB-231细胞转染入miR-382-5p类似物后PDGF-C的表达降低。这就证明miR-382-5p可以作用于PDGF-C mRNA的3’UTR区，降解PDGF-C的mRNA，使PDGF-C表达下调。同时我们利用RT-PCR技术检测恶性程度不同的两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7细胞中miR-382-5p表达情况，结果显示在转移性高的MDA-MB-231细胞中miR-382-5p表达低，而在转移性低的MCF-7细胞中miR-382-5p表达高，符合前面实验结果的逻辑。
　　HuR和miR-382-5p都可以作用于PDGF-C的3’UTR区，且同时存在与乳腺癌肿瘤组织中。将乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞分为3组，第1组MDA-MB-231细胞正常培养，第2组给细胞内转染miR-382-5p类似物，第3组转染HuR的siRNA，western blot实验检测PDGF-C的表达差异。研究发现PDGF-C在第一组表达最高，第二组稍有降低，第三组显著降低，说明HuR和miR-382-5p都可在转录后水平调节PDGF-C的表达，且分别为正向和负向调节。
　　在高转移性乳腺癌中，PDGF-C可激活肿瘤微环境中的成纤维细胞，进而促进肿瘤的增殖、转移。本研究设计一系列实验，发现RNA结合蛋白HuR可作用于PDGF-C mRNA3’UTR区，上调PDGF-C的表达，而miR-382-5p可作用于PDGF-C mRNA3’UTR区，但降低PDGF-C的表达。使我们对乳腺癌的增殖、转移调节机制的研究有了新的方向。

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缩略语表

中文摘要

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文献回顾

实验一

1实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验二

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢