Lin28a在糖尿病心肌病中的保护作用及机制研究

摘要

糖尿病心肌病是一种由于糖代谢紊乱引起的心脏结构改变及功能障碍的心肌疾病，是独立于高血压、冠状动脉粥样硬化等疾病以外的心肌疾病，其早期表现为心肌舒张功能障碍，晚期表现为心肌收缩功能障碍。是糖尿病人群中致残、致死的主要原因之一。一项弗雷明汉心脏研究显示：糖尿病患者心功能不全的发生率比非糖尿病患者高2-5倍，糖尿病性心肌病发生、发展的可能机制是髙血糖和增加的糖基化终产物导致了炎症、氧化应激、心肌纤维化、线粒体损伤、心肌细胞凋亡和自噬。然而，其潜在的机制尚未完全阐明，需要一些有效的策略控制糖尿病心肌病的发生、发展。
　　Lin28基因编码RNA结合蛋白Lin28a/b，可调控细胞增殖，胚胎干细胞分化和肿瘤发生等多种相关基因表达。Lin28a/b参与了胚胎发生和机体生长发育的不同阶段。最新研究表明，Lin28a通过激活insulin-PI3K-mTOR途径，增加葡萄糖摄取及胰岛素敏感性，在葡萄糖代谢中发挥关键作用。我们前期实验研究发现：Lin28a降低了糖尿病状态下的心脏急性缺血再灌注损伤。但是，在糖尿病心肌病形成过程中，Lin28a是否具有保护作用？如具有保护作用，需进一步研究其可能机制。
　　因此，本课题拟构建糖尿病心肌病小鼠模型、过表达及下调Lin28a，观察Lin28a对糖尿病心肌病的保护作用，并研究其发挥作用的分子机制。
　　【研究目的】
　　1.建立糖尿病心肌病小鼠模型，观察Lin28a、线粒体结构及自噬在糖尿病心肌病中的变化。
　　2.构建Lin28a过表达和下调的糖尿病心肌病小鼠模型，明确Lin28a过表达对糖尿病心肌病小鼠心脏收缩、舒张功能、炎性损伤、线粒体结构及功能、凋亡及自噬的影响。
　　3.明确Lin28a发挥糖尿病心肌保护作用的分子机制，证实Lin28a通过cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信号通路参与糖尿病心肌损伤的保护作用。
　　【研究方法】
　　1.构建糖尿病心肌病小鼠模型：选取体重为25-30g雄性8周龄C57BL/6小鼠，随机分为正常组及糖尿病组，糖尿病组小鼠连续5天腹腔注射剂量为50mg/kg的链脲佐菌素（streptozocin，STZ)，糖尿病造模成功的标准为3次随机血糖>16.0mmol/L。继续喂养造模成功的糖尿病小鼠至12周。
　　2.造模成功的糖尿病心肌病小鼠，给予Lin28a siRNA或siRNA心肌点注射，制备心肌Lin28a下调的小鼠模型；给予20(ig Lin28a cDNA或Control vector心肌点注射，制备心肌Lin28a过表达的小鼠模型，分为7组:
　　正常C57小鼠组：Non-DM组
　　糖尿病心肌病小鼠组：DM组
　　糖尿病心肌病小鼠下调对照组：DM+ siRNA组
　　Lin28a下调糖尿病心肌病小鼠组：DM+ Lin28a siRNA组
　　糖尿病心肌病小鼠过表达对照组：DM+ Control vector组
　　Lin28a过表达糖尿病心肌病小鼠组：DM+ Lin28a Overexpression组
　　H89(PKA抑制剂）+ Lin28a过表达糖尿病心肌病小鼠组：DM+H89+ Lin28a Overexpression组
　　心肌病毒点注射后48小时，Western blotting法检测心肌组织中Lin28a蛋白的表达。
　　3.采用小动物超声仪器测量实验小鼠心脏的收缩、舒张功能。
　　4.采用心内导管术测量小鼠左室内压力变化速率（±dp/dtmax)。
　　5.测定心肌组织中IL-6，TNF-a和MPO的活性。
　　6.采用电镜观察心肌细胞线粒体的改变及自噬小体的变化。
　　7.采用比色法测定柠檬酸合成酶及电子传递链活性，发光法测定ATP酶活性。
　　8.通过TUNEL法及Western blotting法检测caspase3表达水平，测定心肌细胞调亡。
　　9.免疫荧光检测各组小鼠心肌组织中LC3的表达。
　　10.Western blotting法检测心肌组织中 Lin28a、LC3、P62、RhoA及 ROCK2的表达。
　　【研究结果】
　　1.3次随机血糖16.0mmol/L视为糖尿病造模成功。
　　2.Lin28a siRNA能够明显降低心肌组织中的Lin28a水平，给予心肌点注射携带有Lin28a基因的慢病毒后，小鼠心肌组织中Lin28a水平明显升高，结果表明，Lin28a上调及下调的糖尿病心肌病小鼠模型制备成功。
　　3.与DM(1.04±0.06)组相比，DM+siLin28a组小鼠心脏舒张功能明显下降，E/A(0.74±0.03)比值降低（P<0.05)，DM+Lin28a组小鼠 E/A(1.51±0.07)比值升高（P<0.05)。与 DM+Lin28a组小鼠比较，DM+H89+Lin28a组的E/A比值降低（1.07±0.05)(P<0.05)。与 DM组 EF值（79.1±2.36)％和FS值(33.9±1.73)%, LVEDV(0.24±0.07) ml和 LVESV(0.05±0.01) ml比较，DM+siLin28a组小鼠心脏的EF值(44.4±1.96)%和 FS值(18.7±1.21)%显著下降，LVEDV(0.34±0.03) ml和 LVESV(0.16±0.02) ml明显升髙，DM+Lin28a组小鼠心脏的EF(68.1±1.32)%和FS值（32.7±2.08)%显著升高，LVEDV(0.21±0.12) ml和LVESV(0.06±0.01) ml明显降低，两组差异有统计学意义(P<0.05)。与 DM+Lin28a组比较，DM+H89+Lin28a组（57.9±2.14)%和 FS值（22.1±1.23%)显著下降，LVEDV(0.28±0.52) ml和LVESV(0.09±0.01) ml明显升高（P<0.05)。Lin28a过表达改善了糖尿病小鼠的左室舒张、收缩功能。PKA抑制剂逆转了 Lin28a过表达改善糖尿病小鼠的左室舒张、收缩功能的作用。
　　4.与DM组相比，DM+siLin28a组小鼠心脏的±LVdp/dtmax显著下降（+LVdp/dtmax：1889.9±112.8vs.3029.3±132.3 mmHg/s;-LVdp/dtmax:2338.5±111.4vs.3076.7±125.1mmHg/s)，DM+Lin28a组小鼠心脏±LVdp/dt max显著升髙（+LVdp/dtmax：3623.2±163.1vs.3029.3±132.3 mmHg/s;-LVdp/dtmax:3066.3±132.8vs.3076.7±125.1mmHg/s)(P<0.05)，与DM+Lin28a组比较，DM+H89+ Lin28a组±LVdp/dtmax显著下降（+LVdp/dt max：2891.7±107.8vs.33623.2±163.1 mmHg/s；-LVdp/dtmax:2737.5±171.6vs.3623.2±163.1mmHg/s)，(P<0.05)。Lin28a过表达改善了糖尿病小鼠的左室舒张、收缩功能。PKA抑制剂逆转了 Lin28a过表达改善糖尿病小鼠的左室舒张、收缩功能的作用。
　　5.与DM组相比，DM+siLin28a组小鼠心肌内IL-6(31.2±3.6vs.18.5±2.3pg/mgprotein)，TNF-a(96.6±13.3vs.51.5±3.7pg/mg protein)和MPO(29.2±3.0vs.8.5±l.lU/lOOmg)均升高（P<0.05)，DM+Lin28a组IL-6(12.4土5.8vs.16.5±2.7 pg/mg protein),TNF-a(30.6±9.1vs.51.5土3.7pg/mg protein)和MPO(3.8±0.7vs.6.5± l.lU/lOOmg)均减低（P<0.05)，与DM+Lin28a组比较，DM+H89+Lin28a组IL-6(18.9±6.6vs.12.4土5.8pg/mgprotein)，TNF-a(48.8土6.7vs.30.6±9.1pg/mg protein)和MPO(7.7土1.1vs.3.8土0.7U/lOOmg)均升高（P<0.05).
　　6.电镜下观察发现，与Non-DM组比较，DM组小鼠心肌组织线粒体结构肿胀、排列紊乱，自噬小体减少，DM+siLin28a组其线粒体结构较DM组损伤更为严重， DM+Lin28a组损伤的线粒体结构得到改善，自噬小体增多，H89+DM+Lin28a组其逆转了 Lin28a的改善作用。
　　7.通过比色法及发光法的测定显示：与D M组比较，DM+siLin28a组心肌组织中线粒体 ATP合成酶（ATP content)(4.0±1.1 vs.5.8±2.3)、柠檬酸合成酶(CS)(63.3±5.1 vs.lll.2±3.4)、线粒体复合物酶(complexes I/III/V)(complexl：3.3±1.2 vs.5.9±1.4，complex JI9.9±1.3 vs.13.1±2.1, complexIII：3.8±1.0vs.5.2±1.4， complex IV14.9±2.3 vs.18.2±2.7，complexV：2.8±0.7vs.4.1±l.l)明显减少(P<0.05)。DM+Lin28a组心肌组织中线粒体ATP合成酶（6.9±1.7 vs.5.8±2.3)、柠檬酸合成酶（147.8±4.8 vs.lll.2±3.4)、线粒体复合物酶（complexl:8.9±1.6vs.5.9±1.4,complex JI16.9±2.3vs.13.1±2.1,complexIII：9.1±1.7 vs.5.2±1.4，complex IV22.1±2.6 vs.18.2±2.7,complex V：5.1±0.6 vs.3.7±1.1)明显增多(P<0.05)，与 DM+Lin28a组相比较，H89+DM+Lin28a组心肌组织中线粒体ATP合成(4.6±1.4vs.6.9±1.7)、柠檬酸合成酶(101.2±3.7vs.147.8±4.8)、线粒体复合物酶（complexI：6.6±1.2 vs.8.9±1.6,complex JI12.9±1.1 vs.16.9±2.3， complex III：6.1±1.1vs.9.1±1.7，complex1V16.9±1.6 vs.22.1±2.6，complex V：3.0±0.4vs.5.1±0.6)明显减少(P<0.05)。
　　8.与DM组小鼠LC3荧光阳性组织数量(21.0±4.4)比较，DM+siLin28a组(3.2±0.5)明显减少（P<0.05)。DM+Lin28a组 LC3(39.2±7.5)明显增多（P<0.05)。与DM+Lin28a组小鼠（21.0±4.4)比较，H89+DM+Lin28a组LC3的荧光阳性组织数量（19.2±3.2)明显减少（P<0.05)。
　　9.与DM组相比，DM+siLin28a组小鼠心肌细胞凋亡指数显著增高（23.4±1.7% vs.17.1±1.3%，P<0.05)，DM+Lin28a组小鼠心肌细胞凋亡指数显著降低（9.1±2.1% vs.17.1±1.3%, P<0.05)。与DM+Lin28a组比较，DM+H89+Lin28a组小鼠心肌细胞凋亡指数显著增髙（(18.1±2.7%vs.9.1±2.1%,P<0.05)。
　　10.Western-blotting检测结果显示，与Non-DM组小鼠相比，DM组小鼠心肌组织中Lin28a表达下调，自噬相关分子p62表达上调，LC3表达下调（P<0.05)。与Non-DM组比较，DM组P62表达水平升高（P<0.05), LC3比值03降(P<0.05)，与D M组小鼠比较，DM+siLin28a组P62表达水平升高（P<0.05)，LC3 Kt值C(3降（P<0.05)，DM+Lin28a组小鼠心肌细胞P62表达水平降低（P<0.05)，LC3比值卸高(P<0.05),与DM+Lin28a组小鼠比较，H89+DM+Lin28a组小鼠P62表达水平升高（P<0.05)， LC3比值C3 I下降(P<0.05)o
　　11.Western-blotting检测结果显示，与Non-DM组比较，DM组心肌细胞RhoA、ROCK2表达水平明显升髙（P<0.05)，与DM组比较，DM+siLin28a组RhoA、ROCK2表达水平较 DM组显著升高（P<0.05)。DM+Lin28a组RhoA、ROCK2表达水平显著降低(P<0.05)，与DM+Lin28a组比较，H89+DM+Lin28a组RhoA、ROCK2表达水平较DM+Lin28a组显著升高（P<0.05)。
　　[结论]
　　通过本实验，我们发现糖尿病导致心肌损害，并首次证实Lin28a改善了糖尿病小鼠心脏收缩、舒张功能和心肌炎性反应及心肌线粒体结构和功能，增加了心肌组织自噬并减少了凋亡。我们随后进一步阐明Lin28a通过cAMP/PKA/RhoA/ROCK2通路发挥心肌保护作用，为预防和治疗糖尿病心肌病提供了新的靶点及重要的理论依据。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1.糖尿病心肌病的研究现状

2 自噬与糖尿病心肌病

3. Lin28

4. cAMP/PKA与 Rho/Rho激酶

第一部分Lin28a在糖尿病心肌病小鼠模型心肌中的改变

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分Lin28a过表达减轻糖尿病心肌病心脏功能障碍研究

1材料

2.方法

3. 结果

4.讨论

第三部分Lin28a通过PKA/RhoA/ROCK2通路增加糖尿病心肌病小鼠心肌自噬

1材料

2.方法

3. 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人筒历和研究成果

致谢