奶牛及养殖环境中大肠杆菌ESBLs基因检测及耐药性分析

摘要

大肠杆菌是常见的人兽共患病原茵之一，对其研究具有重要的医学、兽医学和公共卫生学意义。随着抗茵药物在兽医临床的广泛使用，大肠杆菌耐药菌株迅速出现，多重耐药现象十分普遍，已成为威胁全球医学及公共卫生的严重问题。产超广谱β-内酰胺酶是大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的主要原因，加强对动物源ESBLs产生茵的监测有利于更有效的控制耐药性的产生和传播。本研究旨在了解青岛地区奶牛和养殖环境中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌的耐药性、基因型的分布情况。为指导兽医临床合理用药提供依据，对改善公共卫生，预防奶牛疾病的发生有一定的指导意义。 第一章奶牛及及养殖环境中大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析 2013年3-9月采自青岛地区（6个奶牛场）奶牛及养殖环境中的大肠杆菌，共645份样品，经分离培养、形态观察、生化鉴定，共得到275株大肠杆菌。采用CLSI推荐的K-B纸片扩散法对275株大肠杆菌进行12种抗菌药物的敏感性。 结果显示:275株大肠杆菌对对氟苯尼考的耐药率最高达34.5％，其次是氨苄西林和头孢噻呋，耐药率分别为24.7％和20.4％。对喹诺酮类、氨基糖苷类药物耐药率较低，达5％～11％之间。对亚胺培南高度敏感，耐药率为0％。研究结果袁明牛源大肠杆菌耐药率比较低。 第二章产ESBLs大肠杆菌初步筛选及基因检测 本研究采用CLSI推荐的初筛及表型确认方法对产ESBLs大肠杆菌进行筛选，进而应用PCR扩增进行ESBLs基因检测。 研究结果显示ESBLs阳性率6.18％(17/275)，CTX-M型ESBLs阳性率88.2％(15/17)，OXA型ESBLs阳性率11.8％(2/17)，未检出TEM和SHV。最主要的CTX-M型为CTX-M-G1(n=14)，其次为CTX-M-G9(n=2)，其中CTX型ESBLs从奶样(n=7)、挤奶厅地面(n=3)，饲料(n=2)、粪便(n=2)、污水(n=1)检出，OXA型ESBLs主要从挤奶厅地面(n=2)检出。检出2株同时携带CTX-M-G1、和CTX-M-G9，2株同时携带CTX-M-G1和OXA。青岛地区奶牛及养殖环境中大肠杆菌以OXA型和CTX-M型β-内酚胺酶为主，且产ESBLs大肠杆菌为多重耐药菌株，需引起兽医临床的高度重视。

目录

声明

摘要

前言

文献综述

1 大肠杆菌概述

2 大肠杆菌危害

2．1 犊牛细菌性腹泻

2．2 引起奶牛乳房炎的原因

3 大肠杆菌的耐药机制

4 大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药情况与耐药机制

4．1 大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药情况

4．2 大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

5 β-内酰胺酶分类

5．1 ESBLs来源及分类

5．2 AmpC酶来源于分类

6 ESBLs的检测方法

6．1 CLSI推荐的纸片扩散法

6．2 肉汤稀释法

6．3 自动化仪器检测法

6．4 浓度梯度法(E-test)

6．5 双纸片扩散法

6．6 分子生物学方法

6．7 其他方法

第一章 奶牛及养殖环境中大肠杆菌分离鉴定与耐药性分析

1 材料

1．1 样品来源

1．2 药品

1．3 试剂和仪器

2 方法

2．1 样品采集

2．2 细菌的分离培养

2．3 大肠杆菌的生化鉴定

2．4 大肠杆菌体外药物敏感试验

3 结果与分析

3．1 大肠杆菌分离与鉴定

3．2 大肠杆菌药敏试验结果

4 讨论

4．1 细菌分离率

4．2 不同地区牛源大肠杆菌耐药性

4．3 不同类别药物耐药性分析

第二章 产ESBLs大肠杆菌初步筛选及基因检测

1 材料

1．1 菌株

1．2 药品

1．3 试剂和仪器

1．4 主要溶液的配制

2 方法

2．1 大肠杆菌ESBLs初筛

2．2 ESBLs表型确证试验

2．3 细菌DNA模板的制备

2．4 引物设计及合成

2．5 PCR检测ESBLs基因

3 结果与分析

3．1 初步筛选及确证试验结果

3．2 ESBLs基因检测结果

3．3 产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株耐药性比较

4 讨论

4．1 耐药性

4．2 不同地区流行基因型的差异性

结论

参考文献

致谢