外周循环血微小RNA表达水平与冠心病发病风险的关联分析

摘要

研究背景：
　　缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD），又称冠心病（coronary heart disease， CHD），已经成为人群死亡的最主要病因。多年的临床与基础相关研究证实，冠心病是一种免疫、环境与遗传等多因素交互作用的炎症性疾病，血流动力学变化、感染、应激、炎症反应等因素都可加重其病程。由于冠心病发生的危险因素及发病机制相对比较复杂，具有种族差异和遗传异质性等因素，因此，为了对冠心病进行早期诊断以及早期预防，对其内在发病机制以及相互影响的研究一直锲而不舍地进行着。期望通过研究找到能够更好的阻止该病的发展的重要因素，使得患者的治愈率和生存率得到提高。
　　以往研究发现外周循环血中存在多种微小RNA（MicroRNAs，miRNAs），且与动脉粥样硬化、冠心病等疾病密切相关。
　　miRNAs是一类高度保守的内源性小分子单链非编码RNA，约含20～24个寡核苷酸，结构以及物种保守性非常高，无论是时序性还是组织特异性都很严格，因此，几乎存在于所有的真核微生物中。miRNAs通常靶向一个或多个 mRNA，通过与特定靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）互补性结合对其降解或抑制其翻译，从而在转录后水平对基因表达进行调控。研究发现，存在于外周循环血中的miRNAs，作为一种调节因子，在血管发育、血管再生或心脏发育的过程中发挥重要作用。目前，已发现大约800种的miRNAs，超过1000种mi RNAs能够在人类基因组进行表达。有研究提示 miRNAs可能与心脏病的治疗与预防相关，可作为一种新型的生物标记物，有望成为冠心病治疗的一个新的治疗靶点。目前发现与冠心病相关的miRNAs很多，其中研究较多的有 miR-1、miR-126、miR-133、miR-208和 miR-499等，这些 miRNAs在冠心病患者表达水平异常，提示它们可能是冠心病的潜在生物标志物，但尚未得出一致结论。并且，此类 miRNAs在外周循环血中的表达水平与冠心病患者冠状动脉病变狭窄程度是否具有相关性尚不清楚。
　　本研究旨在探讨外周循环血中 miR-133a、miR-208a和 miR-499a是否能够在冠心病患者中进行表达，同时探讨其与冠状动脉狭窄程度之间的关系，分析外周循环血中的miR-133a、miR-208a和 miR-499a在冠心病发病中的临床预示作用，为进一步探讨冠心病的基因诊断和治疗提供重要的理论依据。
　　目的：
　　1.分析冠心病患者血浆 miRNA-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表达水平与对照组之间的差异。
　　2.分析所有研究病例血浆 miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表达水平与冠状动脉病变狭窄程度的相关性，探讨其在早期诊断和预防冠心病的临床应用价值。
　　方法：
　　1.获得第四军医大学第一附属医院伦理委员会批准，取得患者及家属知情同意后，选取2014年12月至2015年5月于第四军医大学第一附属医院心内科住院并行冠状动脉造影（coronary angiography，CAG）明确诊断为冠心病患者290例作为病例组，年龄30～85周岁，他们之间无血缘关系，冠脉三支主要血管中，至少有一支狭窄程度超过50％。同时选取基线资料配对的110例疑诊冠心病患者，行CAG后，冠状动脉三支主要血管的狭窄程度均小于50%，能够明确排除冠心病，作为对照组。记录所有研究对象的完整病史信息和收集所有研究对象采血所检测的生化检查的临床资料。
　　2.Gensi ni评分是评价冠状动脉病变严重程度的经典评分方法，对400例入选对象按照四分位数间距分为四组：A组99例，Gensini评分≤22分，B组98例，Gensini评分23～55分，C组102例，Gensini评分56～96分，D组101例，Gensini评分≥97分。
　　3.所有研究对象的冠状动脉造影均采用桡动脉或股动脉途径进行。在行冠状动脉造影术前抽取桡动脉或股动脉血5ml于含EDTA抗凝剂采血管中，两次离心后取上清液，分装到EP管储存于-80℃冰箱中备用。
　　4.miRNA检测：将离心得到的血浆取500μl到新的离心管中，用 RNAiso Plus（TaKaRa，Code No.9109），根据试剂操作说明对样本的总RNA进行提取，放在-80℃低温冰箱中保存，进行逆转录。各样本均取样20ng，总RNA应用PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，Code No.RR036A），配制成10μl体系的逆转录（reverse transcription，RT）反应液进行逆转录，得到 cDNA。以 RNU6B为内参。各样本逆转录产物均取2μl应用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，Code No.RR820A），配制成25μl体系的PCR反应液，通过使用ABI7500仪以及对TaqMan探针的应用，对定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）进行实时定量，通过PCR双重特异性引物扩增技术，对miR-133a、miR-208a和miR-499a的Ct值进行检测。内参为RNU6B。
　　5.统计学分析：采用统计学分析软件 SPSS19.0计算各样本的△Ct值（目的基因Ct值-内参基因 Ct值），各样本的相对定量2-△Ct。以均数±标准差（(x)±s）方法处理正态分布的临床基线资料数据及实验数据，采取Mann-Whitney U检验方法对偏态分布的两组数据进行差异比较，通过频数以及百分数表述分类资料。采取独立样本 t检验比较两组miRNA表达水平，采取卡方检验对多组间进行比较，采取Pearson相关分析对两个变量之间的相关性进行比较。以P＜0.05表示具有显著的统计学差异。
　　结果：
　　1.与对照组比较，病例组吸烟患者比例更高，高密度脂蛋白水平更低，存在显著差异（P＜0.05）。但其他因素如年龄、性别、体重、体重指数（BMI）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖、高血压病史、低密度脂蛋白（LDL）、糖尿病史、肌酐、尿酸水平无显著差异（P＞0.05）。
　　2.根据Gensi ni评分按照四分位数间距分为四组，统计分析结果表明，各组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）水平均存在显著差异（P＜0.05）。而年龄、性别、体重、体重指数（BMI）、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、空腹血糖、高密度脂蛋白（LDL）、肌酐、尿酸水平无显著差异（P＞0.05）。
　　3.实时荧光定量 PCR相对定量检测 miRNA结果：与对照组比较，病例组miRNA-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.根据Gensi ni评分按照四分位数间距分为四组，统计分析结果表明，各组之间miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05），且表达水平变化与冠状动脉狭窄程度即Gensini评分呈正相关关系。
　　结论：
　　1.冠心病组血浆 miRNA-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表达水平明显高于对照组，差异显著。
　　2.随着冠状动脉狭窄程度的增加，血浆 miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表达水平也随之增加，各组之间差异显著；表达水平变化和冠状动脉狭窄程度即Gensini评分呈正相关关系。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、冠状动脉粥样硬化性心脏病

二、微小RNA（MicroRNAs， miRNAs）

三、miRNAs与冠心病

1 实验对象

1.1 研究对象

1.2 纳入标准

1.3 排除标准

1.4 伦理学审批及知情同意

1.5 样本量的估算

1.6病史资料及生化检查

1.7冠状动脉造影及Gensini评分

1.8血液样本采集和储存

2 实验材料

2.1 主要仪器及材料

2.2 试剂及其来源

2.3 引物合成

3 实验方法

3.1 Gensini评分系统

3.2 血浆样本处理

3.3 血浆总RNA提取

3.4 总RNA的OD值检测

3.5 总RNA反转录为cDNA

3.6 实时荧光定量PCR

3.7 统计学分析

4 结果

4.1 研究人群的基线资料分布特征

4.2 miRNA检测结果分布特征

5 讨论

5.1循环miRNAs

5.2 miRNAs与冠心病

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢