双丹口服液及其主效成分对糖尿病肾病作用的研究

摘要

研究背景及目的：
　　糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）[1]是在糖尿病（Diabetes mellitus，DM）发病进程中出现的以蛋白尿、高血压、水肿及肾功能损伤等临床症状为特征的疾病；DN的发病是由多因素共同作用的结果，其中氧自由基是 DN发病的重要诱因，患DM时体内自由基生成增多造成氧化应激损伤，同时脂质过氧化物能够直接损伤肾小球基底膜并最终导致肾功能障碍，此外血脂代谢紊乱和肾小球血流动力学异常也是DN发病的主要原因[2]。双丹口服液（Shuangdan Oral Liquid，SDO）的主要活性成分为来源于丹参的丹参素（Danshensu，DSS）和来源于牡丹皮的丹皮酚（Paeonol，Pae）[3-5]，其中DSS具有清除组织中氧自由基的能力[6]；同时DSS还能够降低血液黏度、抑制血小板聚集和改善微循环[7,8]。而Pae具有降低三酰甘油（triacylglycerol，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，T-CHO）和低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）水平的能力[9]，同时Pae还能够抑制脂质过氧化反应和改善血液流变性[10]。由此可见， DN的病理机制恰好与SDO中主效成分DSS和Pae的药理作用相一致，那么，S DO及其主效成分对 DN是否有疗效，并且其机制又如何呢？基于该疑问，本课题组首次设计和研究了SDO及其主效成分对DN的作用及其机制。
　　研究方法：
　　本实验分别借助SD雄性大鼠建立DN动物模型和高浓度葡萄糖环境下肾小球系膜细胞建立细胞模型来评价SDO及其主效成分对DN的作用及其机制。采用MTT、流式细胞术、RT-PCR和Western Blotting等实验方法，观察：①SDO对DN大鼠的作用；②SDO中的主效成分“丹参素+丹皮酚”（DSS+Pae）对DN大鼠的作用；③SDO对肾小球系膜细胞的作用及其机制；④“丹参素+丹皮酚”（DSS+Pae）对肾小球系膜细胞的作用及其机制。
　　实验结果：
　　1、SDO对DN大鼠的作用
　　（1）SDO明显改善DN大鼠的肾功能：与 DN大鼠模型组比较，SDO各给药组显著降低DN大鼠24 h尿量并降低其血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）水平（P＜0.01）。
　　（2）SDO显著改善DN大鼠血脂代谢：与 DN大鼠模型组比较，SDO各给药组明显降低DN大鼠血清中T-CHO、TG和LDL-C的含量，升高HDL-C的含量（P＜0.05）。
　　（3）SDO明显提高 DN大鼠抗氧化应激能力：与 DN大鼠模型组比较，S DO各给药组显著升高血清中 T-AOC及 T-SOD活力并降低 NO及 MDA的含量（P＜0.05）。
　　（4）SDO显著改善DN大鼠肾脏病理性损伤：光镜下肾小球肥大程度和肾小管上皮空泡变性程度都明显减轻。
　　2、DSS+Pae对DN大鼠的作用
　　（1）DSS+Pae明显改善DN大鼠的肾功能：与DN大鼠模型组比较，DSS+Pae各给药组显著降低DN大鼠24 h尿量并降低其BUN和SCr水平（P＜0.01）。
　　（2）DSS+Pae显著改善DN大鼠血脂代谢：与DN大鼠模型组比较，DSS+Pae各给药组明显降低DN大鼠血清中T-C HO，TG和LD L-C的含量，升高H DL-C的含量（P＜0.05）。
　　（3）DSS+Pae明显提高 DN大鼠抗氧化应激能力：与 DN大鼠模型组比较， DSS+Pae各给药组显著升高血清中T-AOC及T-SOD活力和降低NO及MDA的含量（P＜0.01）。
　　（4）DSS+Pae各给药组显著改善DN大鼠肾脏病理性损伤：光镜下肾小球肥大程度和肾小管上皮空泡变性程度都明显减轻。
　　3、SDO对肾小球系膜细胞的影响
　　（1）SDO显著降低了MTT实验中肾小球系膜细胞的活力。
　　（2）SDO明显增加了肾小球系膜细胞G1期的比例。
　　（3）SDO有效降低了肾小球系膜细胞流式中B3的比例。
　　（4）透射电镜下观察到肾小球系膜细胞的线粒体中出现大量空泡并且细胞的核仁明显固缩。
　　4、DSS+Pae对肾小球系膜细胞的影响
　　（1）DSS+Pae显著降低了MTT实验中肾小球系膜细胞的活力。
　　（2）DSS+Pae明显增加了肾小球系膜细胞G1期的比例。
　　（3）DSS+Pae有效降低了肾小球系膜细胞流式中B3的比例。
　　（4）DSS+Pae能明显促进肾小球系膜细胞凋亡：RT-PCR的结果显示，与模型组相比，DSS+Pae组能够显著上调Cyt C，BAX，C ASPASE-3和PARP-1的mRNA表达水平（P＜0.01），同时明显下调了Bcl-2的mRNA表达水平（P＜0.05）；Western Blotting的结果显示，与模型组相比，DSS+Pae组能够明显上调 Cyt C，BAX， CASPASE-3和PARP-1等蛋白的表达水平（P＜0.05），同时显著减少了Bcl-2蛋白的表达水平（P＜0.05）；此外 DSS+Pae组明显降低了细胞线粒体膜电位（P＜0.05）。说明了DSS+Pae可能是通过调控线粒体介导的凋亡途径促进细胞凋亡来降低肾小球系膜细胞数量，发挥了抗DN的作用。
　　实验结论：
　　本课题分别采用体内外动物和细胞实验模型实施研究，证实了SDO及其主效成分对DN具有显著治疗作用，并且创新性地设计了DSS和Pae联合应用于治疗 DN的实验方案，其作用机制可能与改善血脂代谢、提高抗氧化应激能力和线粒体介导的细胞凋亡信号通路有关。上述研究结果为SDO及其主效成分治疗DN的临床应用提供了数据支持，亦为研发以SDO为物效基础的成分清楚的创新药物提供了实验和理论依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 双丹方中成药研究

2 双丹方中成药的临床应用

3 DN的研究进展

4 双丹方中成药的主要代表SD O及其主效成分防治D N的研究进展

实验一 SDO对DN大鼠的作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 丹参素联合丹皮酚对DN大鼠的作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 SDO对肾小球系膜细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 丹参素联合丹皮酚对肾小球系膜细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢