Notch-Hif-1α信号通路参与调控大鼠肝再生过程的研究

摘要

原发性肝癌（肝细胞癌，HCC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一。随着外科技术的发展和进步，肝叶切除术已成为肿瘤治疗的唯一根治手段。但是肝切除术后肝再生障碍引起肝功能衰竭等并发症成为困扰外科医生的一大难题。继续深入地研究肝再生机制，对于临床治疗有十分重要的指导意义。已有的研究发现 Notch信号通路与Hif-1α信号通路均在肝再生中发挥了调控作用。肝再生中Notch信号对Hif-1α信号是否存在着调控关系尚不清楚。阐明这种机制对于肝再生的机制研究有着十分重要的意义。
　　目的：
　　本实验拟利用γ分泌酶抑制剂Fli-06特异性阻断Notch信号通路后，研究大鼠肝部分切除术后肝再生的情况。并提取原代肝细胞研究 Notch-Hif-1α信号的关系，以初步阐明Notch-Hif-1α信号通路调控肝再生的可能机制。
　　方法：
　　1.取SD大鼠分为对照（生理盐水注射组，n=32）和抑制剂组（γ分泌酶抑制剂注射组，n=32）。给予药物处理后，两组分别施行大鼠肝部分切除术，设置术后0天，1天，3天，5天4个时间节点，每个时间点分别留取对照组（n=8）及抑制剂组（n=8）再生的肝组织，并检测相应肝重体重比。
　　2.通过免疫组化法检测两组大鼠肝 Ki-67表达及 PCNA表达，留取血清 ELISA法检测HGF、VEGF蛋白的表达。
　　3.免疫组化法检测两组大鼠肝组织Hif-1α的变化，RT-PCR检测再生肝组织中的Notch1、Hes1、VEGF、Hif-1α、HGF mRNA的变化, Western-Blot法检测NICD、Hif-1α蛋白在肝再生过程的变化情况。
　　4.采用经典的原位两步灌注法提取大鼠的原代肝细胞并行原代肝细胞培养，直至细胞培养成功并贴壁。
　　5.将培养的原代肝细胞分为2组，一组为对照组（加入DMSO），一组为抑制剂组（溶解FLI-06的DMSO），通过RT-PCR方法检测肝细胞中的Notch1、Hes1、VEGF、Hif-1αmRNA的变化, Western-Blot法检测NICD、Hif-1α、VEGF蛋白在肝细胞增殖过程中的变化情况。
　　结果：
　　1．成功构建Notch信号抑制大鼠肝切除模型，发现抑制剂组肝重体重比明显低于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05），进一步通过免疫组化法检测再生肝Ki-67和PCNA表达，发现抑制剂组的Ki67、PCNA在术后1天、3天、5天均较对照组低。
　　2．Western blot结果表明：抑制剂组NICD和 Hif-1α蛋白水平在术后1天、3天、5天明显低于对照组（P﹤0.05）；免疫组化检测发现Hif-1α蛋白水平在术后1天、3天低于对照组（P﹤0.05）；同时RT-PCR结果提示：抑制剂组Hif-1α、Hes1、HGF的mRNA表达量术后1天、3天明显低于对照组，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。同时，抑制剂组VEGF mRNA水平在术后3天、5天明显低于对照组，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。
　　3．顺利提取并培养大鼠原代肝细胞成功，Western blot结果表明：抑制剂组NICD和 Hif-1α、VEGF蛋白水平明显低于对照组（P﹤0.05），RT-PCR结果提示：抑制剂组Hif-1α、Hes1、VEGF的mRNA表达量明显低于对照组，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。
　　结论：
　　在大鼠肝部分切除术后肝再生过程中，使用γ分泌酶抑制剂 Fli-06抑制Notch信号通路后，大鼠的肝再生能力明显降低，Hif-1α信号下调。在原代肝细胞中，抑制Notch信号通路后，同样发现了Hif-1α信号下调。这表明Notch-Hif-1α信号通路可能参与调控了肝再生的进程。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一．肝再生的过程

二．Notch信号通路对肝脏的调控

三．Hif-1α信号通路与肝再生

第一部分 Notch-Hif-1α信号通路参与调控大鼠肝再生过程的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 Notch-Hif-1α信号通路在原代肝细胞中的调控机制

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢