XOD诱导人肝细胞系L-02细胞自噬模型的建立及线粒体机制研究

摘要

背景：
　　自噬（autophagy）是一种自我消化过程，可将各种待消化物质降解成为能够被重新利用的营养成分，从而达到在清除受损细胞器或大分子的同时最大限度地利用自身营养成分的目的。自噬是一种普遍存在的生命现象，它在众多生理及病理条件下均发挥重要作用。正常条件下，细胞的自噬维持在一个相对较低的水平，但多种应激条件可诱导自噬水平的升高，包括氧化应激。氧化应激是指机体或细胞产生的过多活性氧（reactive oxygen species，ROS）无法被抗氧化防御体系所清除，造成的应激作用。氧化应激与自噬的相关性已有很多文献报道，但具体机制仍不清楚。在以往氧化应激与自噬的研究中，自噬通常伴有大量凋亡或坏死，为一种病理性损伤性自噬，而氧化应激诱导生理性自噬研究甚少。
　　黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是一种将黄嘌呤、次黄嘌呤分解并产生ROS的氧化还原酶，已被作为氧化剂广泛应用于研究中。本研究在筛选氧化剂诱导自噬模型过程中，发现XOD可明显诱导L-02细胞自噬，那么该模型与经典自噬模型以及已有的氧化应激诱导的自噬模型有何优势？其中机制如何？对以上问题的系统研究将对建立优效的氧化应激诱导自噬模型，以及针对自噬的分子机制和生物学作用研究提供数据和支撑。
　　目的：
　　1．建立一种XOD诱导的细胞自噬模型；
　　2．探讨XOD诱导自噬模型过程中线粒体氧化应激作用及分子机制。
　　方法：
　　1．体外培养L-02细胞，采用不同浓度氧化剂（H2O2、GOX、t-BHP、PQ和XOD）、自噬诱导剂（EBSS和Rapamycin）、自噬抑制剂（3-MA）以及多种抗氧化剂（NAC、和MitoQ）对细胞进行处理；
　　2．采用免疫荧光检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ分布状况,MDC染色检测自噬溶酶体数量及分布；
　　3．Western Blot检测标志蛋白LC3Ⅱ、p62等蛋白水平以及AKT、ERK、AMPK、p38、mTOR和ULK1等细胞信号通路分子的激活状况；
　　4．透射电子显微镜观察线粒体和细胞自噬小体的形态及数量；
　　5．DCFH-DA和Mito-SOX Red染色流式法分别检测细胞ROS和线粒体ROS水平；
　　6．JC-1染色，共聚焦观察细胞膜电位变化；
　　7．Mn-SOD及CAT试剂盒检测细胞内SOD2及CAT活性；
　　8．荧光定量PCR检测细胞内线粒体DNA拷贝数；
　　9. mRFP-GFP-LC3腺病毒转染细胞，以观察细胞自噬通量；
　　10．采用siRNA对细胞内Atg5基因进行干扰，降低Atg5蛋白的表达；
　　11．采用慢病毒转染细胞以单独高表达细胞内SOD2、CAT以及M-CAT，或共转染同时高表达SOD2&CAT以及SOD2&M-CAT；
　　12．Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡水平。
　　结果：
　　1．L-02细胞活力随各氧化剂（H2O2、GOX、t-BHP、PQ和XOD）浓度增大而降低，一定浓度H2O2、t-BHP、PQ和XOD处理条件下，自噬标志蛋白LC3Ⅱ水平均有不同程度升高。
　　2．L-02细胞经无细胞毒性剂量 XOD处理后，MDC染色结果显示，指示酸性自噬泡的蓝色荧光点明显增多且亮度增强，免疫荧光法标记LC3蛋白的荧光点增多， Western Blot检测的LC3Ⅱ蛋白水平明显上调，TEM结果显示细胞的自噬体形成增加，各指标均呈一定的剂量效应关系。mRFP-GFP-LC3腺病毒转染 L-02细胞后再给予XOD处理，细胞自噬通量明显增加。
　　3．XOD、EBSS以及Rapamycin分别处理L-02细胞，2h、8h和24h后分别检测自噬相关指标MDC染色、IF-LC3染色、LC3Ⅱ蛋白水平，以及细胞自噬小体数量的变化，结果显示XOD较经典自噬诱导剂各指标变化均更为明显。
　　4．通过剂量筛选，一定剂量的t-BHP、PQ和XOD均可使L-02细胞LC3Ⅱ蛋白水平明显升高，但在引起细胞自噬的同时，t-BHP和PQ可引起明显的细胞凋亡或坏死，而XOD处理组细胞存活状态无明显变化。
　　5．XOD处理细胞后，细胞内总体ROS及线粒体ROS水平明显升高。给予NAC或MitoQ处理后，Western Blot结果显示自噬标志蛋白LC3Ⅱ水平明显下降。此外，通过慢病毒转染过表达抗氧化酶SOD2和/或CAT/M-CAT，各组ROS水平均有不同程度的降低，其中SOD2&CAT和SOD2&M-CAT共转染组细胞内总ROS以及线粒体 ROS水平均明显降低，在此基础上，XOD处理引起的LC3Ⅱ蛋白水平也相应明显降低。
　　6．XOD处理L-02细胞后，Western Blot结果显示ROS相关信号通路AKT、p38/MAPK、ERK和AMPK以及自噬相关蛋白ULK1蛋白磷酸化水平显著增加。联合过表达SOD2&CAT和SOD2&M-CAT抗氧化蛋白后可以有效拮抗XOD处理引起的AKT、AMPK及ULK1蛋白磷酸化水平的升高。
　　7．抑制XOD诱导的自噬，细胞内ROS和线粒体ROS水平及细胞的死亡程度均增加。
　　8．XOD处理L-02细胞后，JC-1结果显示线粒体膜电位降低，TEM观察细胞内有线粒体自噬现象，免疫荧光双标发现LC3自噬荧光点与线粒体共定位，即发生了线粒体自噬，且荧光定量PCR检测到线粒体DNA拷贝数明显减少。
　　结论：
　　我们成功建立了XOD诱导L-02细胞的自噬模型，与常规自噬诱导剂相比该模型具有诱导效果明显、易检测及不伴随凋亡或坏死等优点。线粒体ROS在介导了此过程的发生，ROS通过信号通路AKT和 AMPK诱导自噬的发生。线粒体自噬可以通过调控线粒体数量进而调控ROS水平，维持细胞生存。

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前言

文献回顾

1 自噬的概念

2 自噬的基本过程

3 自噬的基本生物学作用和功能

4 自噬的调控

5 研究自噬的常用工具和方法

1 材料

1.1 实验对象

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 细胞培养

2.2 细胞活力测定

2.3 Western Blot

2.4 MDC染色

2.5 免疫荧光

2.6 自噬体显微观察

2.7 siRNA转染

2.8 ROS测定

2.9 L-02细胞慢病毒转染

2.10 腺病毒转染

2.11 SOD2活性检测

2.12 CAT活性检测

2.13 细胞凋亡检测

2.14 荧光定量PCR

2.15 统计学分析

3 结果

3.1 氧化应激自噬模型的建立

3.2 XOD诱导自噬模型的确立

3.3 XOD诱导的自噬模型的优势评价

3.4 ROS介导XOD诱导的自噬

3.5 XOD诱导细胞自噬的分子机制

3.6 XOD诱导的自噬对细胞的保护作用

3.7 线粒体在XOD诱导自噬过程中的作用

4 讨论

4.1 氧化应激模型的建立

4.2 XOD诱导自噬模型的确立

4.3 XOD诱导的自噬模型的优势评价

4.4 线粒体ROS介导XOD诱导的自噬

4.5 XOD诱导细胞自噬的分子机制

4.6 XOD诱导的自噬对细胞的保护作用

4.7 线粒体在XOD诱导自噬过程中的作用

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢