心肌缺血/再灌注损伤中蛋白磷酸酶PHLPP1的表达调控及作用机制研究

摘要

研究背景：
　　缺血性心脏病（IHD）是危害国人健康的重要疾病，及时恢复血流灌注是改善临床预后的最有效策略。但再灌注会加重单纯心肌缺血造成的损伤，即心肌再灌注损伤。如何最大限度减轻心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤，提高缺血性心肌病救治效果，是心血管领域亟待解决的重要问题。因此，探寻再灌注损伤发生的分子机制，将为临床更好的救治急性心肌梗死提供理论依据。
　　蛋白磷酸酶PHLPP，是目前发现的Akt特异性磷酸酶，可使Akt去磷酸化失活，进而促进细胞凋亡，抑制肿瘤的生长和增殖。近年来的研究表明，该蛋白磷酸酶家族中的一种异构体，PHLPP1，在心肌I/R损伤以及衰老心肌缺血易损性中扮演重要角色。然而，心肌I/R本身对PHLPP1蛋白表达的影响，及其调控机制，目前尚未见报道。此外，我们前期的工作证实，胰岛素可通过泛素蛋白酶体通路促进 PHLPP1的蛋白降解，强化其心肌保护作用。研究表明，当胰岛素通路受损时，即肥胖伴有胰岛素抵抗病人骨骼肌中PHLPP1表达上调。提示PHLPP1与胰岛素抵抗关系密切。胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理生理学基础。然而，糖尿病条件下，心肌中PHLPP1的变化及其在糖尿病心肌缺血易损性中的作用，目前仍不清楚。
　　实验目的：
　　1.明确心肌I/R对PHLPP1表达的影响；进一步阐明影响心肌PHLPP1表达的具体分子机制。
　　2.探讨PHLPP1在胰岛素抵抗心肌缺血易损性中的作用。
　　实验方法：
　　1.心肌I/R调节PHLPP1表达的机制研究：采用10~12周龄雄性C57BL/6小鼠，构建急性心肌I/R模型，再灌注不同时间点（30 min，1 h，2 h，3 h，4 h）收集缺血区心肌组织。取1~3天龄 SD大鼠，培养原代乳鼠心肌细胞，采用离体缺氧/复氧（H/R）模拟心肌I/R，缺氧4 h，在复氧不同时间点（1 h，2 h，3 h，4 h）收集心肌细胞；按照实验方案设计用TNF-α（20 ng/mL），H2O2（150μM）及相应抑制剂（依那西普：1μg/mL、NAC：5 mM）预处理心肌细胞。采用蛋白质免疫印迹方法检测相关蛋白表达。细胞免疫荧光染色方法观察转录因子 NF-κB表达及其核转位。采用染色质免疫共沉淀（ChIP）方法确定NF-κB与phlpp1基因上游启动子区域的相互作用。
　　2.PHLPP1在糖尿病心肌缺血易损性中的作用研究：采用雄性ob/ob小鼠（10~12周龄）和同周龄的野生型C56BL/6小鼠，构建急性心肌I/R模型，缺血30 min，再灌注2 h取缺血区心肌组织检测蛋白表达，再灌注24 h检测心肌梗死面积。采用蛋白质免疫印迹实验检测蛋白表达水平，ELISA方法检测血清TNF-α水平。取缺血区心肌组织制备石蜡切片，采用免疫荧光染色和TUNEL染色方法检测蛋白表达及细胞凋亡。整体水平通过葡萄糖耐量实验（IPGTT）和胰岛素敏感性实验（IST）确定实验动物对胰岛素的反应性。培养乳鼠原代心肌细胞，采用高糖+胰岛素（Glucose：4,500 mg/L；Insulin：100 nM）长时间（24 h）预处理心肌细胞模拟胰岛素抵抗。心肌细胞转染PHLPP1特异siRNA，随后进行H/R处理，并检测细胞培养液上清中LDH水平。采用JC-1荧光染色方法观察线粒体膜电位变化情况，并用流式细胞术检测细胞凋亡。整体动物水平，分离心肌细胞线粒体，检测PHLPP1在细胞中的转位变化。
　　实验结果：
　　1.I/R及H/R后心肌PHLPP1蛋白水平出现时程变化。整体动物水平，再灌注2 h心肌PHLPP1表达有上调趋势，但无统计学差异，而再灌注4 h PHLPP1蛋白水平明显降低；原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中，复氧1 h心肌PHLPP1表达上调，复氧4 h时，PHLPP1蛋白水平明显减少；
　　2.炎症和氧化应激共同调节PHLPP1蛋白表达。作为再灌注损伤的重要始动因素，炎症反应上调PHLPP1表达。采用重组TNF-α处理心肌细胞1 h显著上调PHLPP1蛋白水平，与之相比，TNF-α处理4小时PHLPP1蛋白水平有所减少；用TNF-α抑制剂依那西普（Etanercept）预处理心肌细胞，显著抑制TNF-α作用1 h PHLPP1的蛋白水平。H2O2诱导的氧化应激对PHLPP1表达无明显影响，但抗氧化剂NAC预处理心肌细胞可上调H2O2刺激4 h心肌PHLPP1蛋白水平。此外，短时间（1 h）炎症因子和氧化应激共同作用与TNF-α单独刺激对PHLPP1蛋白水平的影响一致，表现为TNF-α的上调作用；二者共同作用时间延长至4 h，表现为H2O2的抑制作用。TNF-α抑制剂Etanercept预处理显著降低复氧1 h引起的PHLPP1高表达，而NAC预处理后PHLPP1的表达无明显改变；另一方面，抗氧化剂NAC预处理可以上调复氧4 h后心肌PHLPP1水平。
　　3.TNF-α活化NF-κB核转位活性介导PHLPP1表达。TNF-α是激活经典NF-κB信号通路的重要配体。采用PDTC（NF-κB抑制剂）预处理显著降低TNF-α处理1小时引起的PHLPP1表达上调；相应地，PDTC使缺氧/复氧后PHLPP1的表达明显减少。随后找到 phlpp1基因上游的启动子区域，通过软件预测，得到 phlpp1基因启动子区域可能与转录因子 NF-κB发生相互作用的片段：-83~-92(I)，-884~-893(II)，-1,383~-1,392(III)和-1,465~-1,474(IV)。采用染色质免疫共沉淀（ChIP）方法，确定NF-κB与phlpp1启动子区域-1,383~-1,392(III)存在蛋白质与核酸之间的相互作用，而PDTC预处理可抑制二者间的结合。
　　4.Ob/ob小鼠出现明显的全身胰岛素抵抗，并且，与野生型相比，ob/ob小鼠心肌I/R之后心肌梗死面积增加。同时，蛋白质免疫印迹与荧光染色结果均显示，ob/ob小鼠心肌PHLPP1本底水平明显上调，但心肌I/R之后PHLPP1蛋白表达减少。与之对应，采用原代乳鼠心肌细胞模拟胰岛素抵抗模型，此时心肌PHLPP1水平显著高于正常组。在此基础上给予H/R处理，PHLPP1表达出现一定程度的下调。
　　5.胰岛素抵抗时，TNF-α介导心肌PHLPP1的表达。我们发现ob/ob小鼠血清中TNF-α水平远远高于野生型，而I/R后TNF-α含量显著降低。另一方面，模拟胰岛素抵抗心肌细胞中，NF-κB的磷酸化水平以及 TNF-α mRNA水平显著高于Control组，但H/R后pNF-κB表达降低，与心肌PHLPP1的表达趋势一致。
　　6.下调PHLPP1表达减轻胰岛素抵抗心肌细胞H/R损伤。采用siRNA下调PHLPP1蛋白水平，可使胰岛素抵抗心肌细胞本底及缺氧/复氧后培养基上清中LDH水平明显减少。流式细胞术及Caspase3活化程度检测结果均显示，下调PHLPP1表达可减轻胰岛素抵抗心肌细胞缺氧/复氧导致的细胞凋亡。
　　7.下调PHLPP1表达增强心肌细胞线粒体膜电位。线粒体膜电位下降是线粒体介导的细胞凋亡通路的标志性事件之一。采用JC-1荧光探针标记，观察线粒体膜电位变化。我们发现胰岛素抵抗心肌细胞线粒体膜电位下降，H/R后膜电位进一步降低。与之对应，采用siRNA抑制PHLPP1蛋白水平使胰岛素抵抗心肌细胞本底及H/R后线粒体膜电位明显上升。
　　8.I/R增强ob/ob小鼠心肌PHLPP1向线粒体转位。心肌I/R后，野生型小鼠心肌细胞线粒体中PHLPP1表达上调；与之相比，ob/ob小鼠心肌细胞中PHLPP1向线粒体转位明显增加。
　　结论：
　　1.心肌I/R及H/R过程中，炎症反应和氧化应激共同参与调控心肌PHLPP1表达。一方面，炎症因子TNF-α活化NF-κB向细胞核转位，介导PHLPP1的转录表达调控；另一方面，H2O2引起的氧化应激作用后期抑制PHLPP1表达。
　　2.胰岛素抵抗ob/ob小鼠心肌I/R后PHLPP1向线粒体转位增强，后者抑制线粒体功能并促进心肌细胞凋亡，导致胰岛素抵抗心肌缺血损伤加重。

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文献回顾

第一部分 心肌缺血/再灌注损伤中调节蛋白磷酸酶PHLPP1表达变化的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 蛋白磷酸酶PHLPP1在胰岛素抵抗心肌缺血/再灌注损伤中的作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

小结

创新性及展望

参考文献

个人简历和研究成果

致谢