阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒的制备及其抗肿瘤活性评价

摘要

目的：
　　阿霉素（doxorubicin，DOX）对乳腺癌等肿瘤疗效确切，价格低廉，但其毒副作用显著，而且肿瘤细胞易对DOX产生耐药，成为DOX临床应用最常见和难以克服的问题。本研究以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为内核，采用茴香酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHOL）对PLGA纳米粒进行修饰，并将DOX和白藜芦醇（resveratrol，RES）共同包封于PLGA纳米粒中，得到阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒（NPS），使DOX和RES在体内具有肿瘤靶向性，延长DOX和RES在体内的循环时间，克服肿瘤细胞对DOX的耐药，增强DOX的抗肿瘤作用，同时降低DOX对正常组织的毒性。
　　方法：
　　1.采用乳化溶剂挥发法制备表面修饰 AA-PEG-hyd-CHOL的共同包封 DOX和RES的PLGA纳米粒（NPS），并用纳米粒度及zeta电位分析仪和透射电镜对纳米粒进行表征。
　　2.采用荧光分光光度法研究NPS在不同pH（pH5.0，pH6.5和pH7.4）缓冲液中释放DOX和RES的动力学。
　　3.采用MTT实验研究NPS、DOX、RES以及DOX和RES混合溶液（MIX）对MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的细胞毒性；通过试剂盒检测 NPS、DOX、RES以及 MIX对 MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞中Caspase-3活性的影响。
　　4.通过激光共聚焦显微镜观察 MDA-MB-231/ADR细胞和 MCF-7/ADR细胞对NPS、DOX、RES以及MIX的摄取，并观察DOX和RES在MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞内的分布。
　　5.采用流式细胞术以及 Western blot检测 NPS、DOX、RES以及 MIX对MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞细胞周期以及周期相关蛋白表达的影响。
　　6.采用Western blot检测NPS、DOX、RES以及MIX对MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞凋亡相关蛋白以及耐药相关蛋白表达的影响。
　　7.采用MTT实验研究NPS、DOX、RES以及MIX对A549细胞的细胞毒性；采用Western blot检测NPS、DOX、RES以及MIX对A549细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。
　　8.复制裸鼠MDA-MB-231/ADR细胞移植瘤模型，以肿瘤体积为指标，观察NPS、DOX、RES的体内抗肿瘤活性。采用活体成像仪观察NPS递送DOX和RES在荷瘤裸鼠体内的分布，采用荧光显微镜观察NPS递送DOX和RES在正常器官组织和肿瘤组织切片中的分布。对组织切片进行 H&E染色，观察 NPS、DOX、RES对正常器官组织以及肿瘤组织形态的影响。对肿瘤组织内的蛋白进行提取，观察NPS对肿瘤组织中凋亡相关蛋白以及耐药相关蛋白表达的影响。
　　9.复制裸鼠A549细胞移植瘤模型，以肿瘤体积为指标，观察NPS、DOX、RES的体内抗肿瘤活性。采用活体成像仪观察NPS递送DOX和RES在荷瘤裸鼠体内的分布，采用荧光显微镜观察NPS递送DOX和RES在正常器官组织和肿瘤组织切片中的分布。对组织切片进行 H&E染色，观察 NPS、DOX、RES对正常器官组织以及肿瘤组织形态的影响。
　　结果：
　　1. NPS的平均粒径为（204±27）nm，zeta电位为（-15.8±0.8）mV，DOX和RES的载药量分别为（4.6±1.4）％和（15.5±5.3）%。
　　2. NPS释放DOX和RES呈pH依赖性，当孵育时间为24h时，NPS在pH5.0的缓冲液中，DOX和RES的累积释药量分别达到了67.7%和81.4%；在pH7.4的缓冲液中，DOX和RES的累积释药量只有43.7%和43.6%。
　　3. NPS可剂量依赖性地抑制 MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的生长；NPS可浓度依赖性地增加 MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞内Caspase-3的水平。
　　4. NPS可时间依赖性地增加 DOX和 RES在 MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞核内的蓄积。
　　5. NPS能够显著降低MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及CDK4的表达，诱导MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞发生G1期阻滞。
　　6.NPS可显著降低MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞中耐药相关蛋白P-gp、MRP-1和BCRP的表达。此外，NPS还能够显著降低MDA-MB-231/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞中凋亡相关蛋白NF-κB和BCL-2的表达，并且上调Bax的表达。
　　7. NPS可剂量依赖性地抑制A549细胞的生长，显著降低A549细胞中细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及CDK4的表达，使细胞发生G1期阻滞。此外， NPS能够显著降低A549细胞中NF-κB和BCL-2蛋白的表达，并且上调Bax蛋白的表达。
　　8. NPS可剂量依赖性地抑制裸鼠 MDA-MB-231/ADR细胞移植瘤的生长。NPS可有效递送RES和DOX于MDA-MB-231/ADR细胞移植瘤组织中，并减少RES和DOX在其他正常器官组织中的蓄积，尤其是DOX在心脏组织中的蓄积。H&E染色结果表明，NPS可显著降低DOX的心脏毒性。Western blot结果表明，与空白对照组相比，NPS可显著降低肿瘤组织P-gp、BCRP、MRP-1、BCL-2以及NF-κB的表达，同时上调Bax和Caspase-3的表达。
　　9. NPS可有效递送RES和DOX于A549细胞移植瘤组织中，剂量依赖性地抑制裸鼠A549细胞移植瘤的生长，减少RES和DOX在正常器官组织中的蓄积，尤其是DOX在心脏组织中的蓄积。H&E染色结果表明，NPS可显著降低DOX的心脏毒性。
　　结论：
　　NPS可有效递送DOX和RES至肿瘤组织，减少了DOX在正常组织中的蓄积，降低了对正常组织的毒性，可剂量依赖性地抑制裸鼠 MDA-MB-231/ADR细胞移植瘤以及A549细胞移植瘤的生长。NPS克服肿瘤细胞对DOX的耐药、增强DOX的抗肿瘤活性与其下调耐药相关蛋白（P-gp，MRP-1和BCRP）、NF-κB蛋白和BCL-2蛋白表达，同时上调Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达有关。

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前言

文献回顾

1、乳腺癌的临床治疗现状

2、阿霉素治疗乳腺癌的现状

3、阿霉素耐药的产生机制

4、克服肿瘤耐药的方法

实验一阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒的制备及其表征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒对耐阿霉素乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒对裸鼠MDA-MB-231/ADR细胞移植瘤的抑制作用及机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 阿霉素和白藜芦醇共递送PLGA纳米粒对裸鼠A549细胞移植瘤的抑制作用及机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

研究成果

致谢