双功能3p-siRNA沉默HER2基因表达和激活RIG-I信号通路治疗胃癌的研究

摘要

胃癌是全球范围内最常见的癌症之一，也是导致癌症相关死亡的常见原因。目前手术切除和放化疗仍是胃癌治疗的主要手段，因其治愈性差，复发率高，所以这就要求我们积极地寻找靶向药物。许多研究发现，免疫应答相关基因、代谢酶基因、DNA修复基因、肿瘤抑制基因和胃黏膜保护基因的变异或表达的改变与胃癌的发生具有很强的关联性。HER2为原癌基因，位于染色体17q21上，当原癌基因激活过度表达，使得细胞膜上的HER2受体表达增多，促进细胞癌变，最终导致癌症的发生。目前越来越多的证据表明HER2过表达与胃癌患者不良预后及复发率亦密切相关。荧光原位杂交技术和免疫组织化学方法发现胃癌患者中约有7％～35%的HER2阳性患者。临床前数据显示HER2特异单克隆抗体在体内体外实验中均具有显著的抗胃肿瘤效果，但在HER2阳性患者中应答率较低。目前RNAi已经被用于很多疾病的治疗研究中。新的研究发现，部分siRNA，特别是经过修饰的siRNA具有免疫激活的作用，可识别机体内固有的免疫受体。这一发现为癌症的治疗打开了新的视角。
　　本研究通过设计合成 HER2基因特异siRNA，利用生物学方法合成具有免疫激活能力的HER23p-siRNA，研究其对胃癌细胞HER2基因表达及免疫激活的双重影响，探究双功能HER23p-siRNA对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。
　　本课题包括以下三部分内容。
　　第一部分、HER23p-siRNA的合成及鉴定
　　实验主要目的是利用生物学方法设计、合成HER23p-siRNA，对合成产物进行鉴定。首先以NCBI数据库为基础，设计合成了3条 HER2基因特异性siRNA，通过检测siRNA干扰后细胞内HER2的mRNA和蛋白表达水平，选择干扰效率最佳的siRNA2，以siRNA2序列为模板合成HER23p-siRNA。生物学方法合成HER23p-siRNA，经琼脂糖凝胶电泳，验证合成的HER23p-siRNA与siRNA2具有相同的序列长度；荧光素酶活性检测结果显示HER23p-siRNA可显著激活IFN-β启动子的活性。
　　第二部分、HER23p-siRNA特异性沉默HER2基因表达和激活RIG-I信号通路实验主要探究HER23p-siRNA在胃癌细胞中对HER2基因的干扰作用及免疫激
　　活功能，同时探究双功能HER23p-siRNA对胃癌细胞凋亡及凋亡机制的研究。研究结果发现3p-siRNA可非特异性激活RIG-I，pIRF-3进而促进细胞内IP-10，和MHC-I的表达，同时，该3p-siRNA可以特性抑制细胞内HER2蛋白的水平，另外我们观察到该3p-siRNA可明显增加胃癌细胞凋亡并抑制细胞增殖。进一步的机制研究发现HER23p-siRNA能激活细胞内促凋亡蛋白Noxa和细胞色素C的表达，进而诱导Caspase-3和Caspase-9的活化，启动细胞凋亡。此外，Cisplatin与HER23p-siRNA的联合使用能有效降低胃癌细胞增殖及增加细胞凋亡。
　　第三部分：双功能HER23p-siRNA对荷瘤小鼠胃肿瘤增殖作用的体内研究
　　通过小鼠体内实验探究HER23p-siRNA对肿瘤凋亡和生长或增殖的影响。首先我们在体外验证了HER23p-siRNA对小鼠胃癌细胞MFC的HER2干扰及免疫蛋白活化的影响。然后腹部皮下注射小鼠胃癌细胞MFC建立了小鼠体内肿瘤模型，通过尾静脉注射HER23p-siRNA，探究HER23p-siRNA对荷瘤小鼠肿瘤组织凋亡和生长的影响及其机制。细胞实验表明生物法合成的小鼠HER23p-siRNA不仅可抑制MFC细胞内HER2的表达，还同时促进RIG-I，pIRF-3，IFN-β，MHC-I和IP-10的表达，增加MFC细胞凋亡及降低增殖。动物体内观察到HER23p-siRNA能增加小鼠血清IFN-β及IFN-γ的浓度，显著抑制肿瘤的生长，且对小鼠肝脾肾肺的毒性较弱。肿瘤组织中可见HER23p-siRNA显著激活了IP-10，IFN-β，IFN-γ的表达，CD8+T细胞组织浸润能力增强。HER23p-siRNA和Cisplatin的联合使用可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，为联合用药提供了新的思路。
　　本实验合成了特异性靶向HER2基因的3p-siRNA，并通过体内体外实验探究HER23p-siRNA对胃癌细胞凋亡和增殖的影响，初步探究了其作用机制。这种兼具有靶基因沉默作用和免疫激活作用的双功能3p-siRNA具有改善胃肿瘤微环境、发挥免疫监视、解除免疫抑制的作用，该研究为HER2阳性胃癌患者寻找新的治疗方法奠定了实验基础，提供了新的思路。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1人体免疫

2模式识别受体

3胃癌研究进展

4 RNA干扰

第一部分HER2特异性3p-siRNA的合成与鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第二部分HER2-3p-siRNA特异性沉默HER2基因和激活RIG-I信号通路

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第三部分双功能HER2 3p-siRNA对荷瘤小鼠胃肿瘤增殖作用的体内研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

总结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢