同型半胱氨酸诱导内质网应激及线粒体应激调控大鼠心肌细胞凋亡及牛磺酸干预的研究

摘要

高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHcy）是心血管疾病的独立危险因素，中等程度的血清同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）水平升高即可增加罹患心衰的风险。受饮食习惯的影响，我国人群Hcy水平普遍高于西方国家，其中以轻中度HHcy在临床上较为常见。目前，由于人们并未足够重视HHcy对心血管的危害作用，导致血清Hcy水平未能得到及时有效干预，使心血管受到不可逆的损伤，促进了心血管不良事件的发生。虽然升高的Hcy水平可诱导血管内皮细胞及平滑肌细胞损伤，促进血栓形成，导致动脉血栓事件发生已被广泛证实，但是升高的Hcy水平对心肌细胞影响如何目前研究尚不充分。我们前期研究表明，轻中度HHcy可促进高血压对心脏的损害，加重高血压患者的左室重构，导致高血压患者心功能明显降低。然而，HHcy单独存在能否对心肌细胞造成损伤，从而影响心脏结构与功能，以及其分子生物学机制如何目前尚不可知。
　　内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）过度激活可诱导细胞凋亡，该机制是多种心血管疾病发生发展的重要病理基础。缺血缺氧、高血压及高糖血症等都可激活心肌细胞ERS，过度或持久的ERS可诱导促凋亡因子的表达，调控心肌细胞凋亡，从而影响心脏结构及功能。我们前期研究表明，HHcy可加重高血压诱导的心肌细胞ERS，引起促凋亡因子caspase-12及C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）表达明显上调，激活了促凋亡信号通路，可能调控了心肌细胞凋亡，因此促进了高血压大鼠心肌重构。然而，HHcy单独作用于心脏时是否能激活心肌细胞ERS，以及激活的ERS是否直接了调控心肌细胞凋亡目前尚不清楚。线粒体是心肌细胞另一重要的细胞器，除了产生维持细胞存活的ATP和调节细胞代谢之外，还在细胞凋亡和坏死过程中起关键作用。线粒体不仅参于了内部凋亡途径的触发，也参于了外部凋亡途径的放大。然而，Hcy是否引起心肌细胞线粒体功能障碍，并促进心肌细胞凋亡事件的发生目前尚不清楚。目前研究表明，线粒体与内质网间有密切的联系，ERS可影响线粒体功能，因此有学者提出了内质网-线粒体轴的概念。内质网是心肌细胞Ca2+存储重要场所，而内质网腔Ca2+的紊乱是激活ERS的关键因素；过度的ERS可导致Ca2+由内质网腔转移至胞质引起胞质内Ca2+浓度增加，而胞质内Ca2+浓度增加恰好是诱导线粒体应激导致线粒体功能障碍的重要原因。这可能是ERS与线粒体功能障碍间信号传导机制之一，是否存在其它信号传导机制目前尚在探索中。在HHcy环境下，心肌细胞是否存在线粒体功能障碍，以及其与ERS间存在何种关系目前尚不可知。
　　牛磺酸与Hcy同是含硫氨基酸，两者有相同的生成途径，却对心血管发挥截然相反的作用。牛磺酸在人体内含量丰富，其中心脏中牛磺酸含量约占体内牛磺酸总量的75％。研究表明，牛磺酸对心血管起保护作用，适量的牛磺酸补充可发挥降压、降脂及降糖的功效。牛磺酸已经被用于临床治疗心功能衰竭患者，据报道补充牛磺酸可使洋地黄或者利尿剂不敏感的心衰患者获益。牛磺酸可通过有效清除氧自由基、维持细胞Ca2+稳态及确保蛋白正确折叠发挥其保护功能。目前较多研究报道了牛磺酸可抑制脑细胞的ERS，改善线粒体功能障碍，治疗脑功能相关疾病。然而，在HHcy环境下，牛磺酸是否能保护心肌细胞线粒体功能及抑制心肌细胞ERS，从而改善心脏结构及功能，目前尚不明确。
　　鉴于上述情况，本课题拟在已有文献报道及前期工作的基础上，首先通过建立HHcy大鼠模型观察HHcy是否损害大鼠心脏结构及功能，并探讨ERS和线粒体应激在此过程中所起的作用；观察牛磺酸干预对HHcy大鼠心脏结构及功能的保护作用，并研究其保护心肌细胞的相关分子机制。其次，通过体外研究观察Hcy对H9C2心肌细胞ERS的影响，探讨其是否直接调控了细胞凋亡；观察Hcy对H9C2心肌细胞线粒体功能的影响，探讨其是否促进了细胞凋亡事件的发生，以及初步探讨其与ERS之间潜在信号传导机制；通过观察牛磺酸对H9C2心肌细胞ERS及线粒体应激的干预作用，探讨牛磺酸对抗Hcy心肌细胞毒性作用的分子机制。
　　第一部分、动物实验
　　HHcy诱导大鼠心肌结构及功能变化的分子机制及牛磺酸干预的研究
　　目的：研究HHcy对大鼠心肌结构及功能的影响，以及探讨ERS和线粒体应激在此过程中所起作用；研究HHcy环境下，牛磺酸对心肌细胞的保护作用及保护机制。
　　方法：将30只Wistar大鼠随机分为三组，分别为对照组：普通颗粒饲料喂养及饮用自来水；高蛋氨酸组：含3%蛋氨酸颗粒料喂养及饮用自来水；牛磺酸组：含3%蛋氨酸颗粒料喂养及饮用含牛磺酸2% w/v的自来水。各组大鼠饲养第20周末，分别采用无创鼠尾动脉血压仪检测大鼠心率及SBP；便携式Hcy检测仪检测血清Hcy水平；小动物超声检测大鼠心脏功能；颈动脉插管检测心脏血流动力；免疫组化检测GRP78、CRT、Bcl-2及Bax在心肌中表达；Western blot检测TUAT、GRP78、CRT、caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3及Cyt c在心肌中蛋白表达水平；柱前衍生化反相高效液相色谱法测定心肌组织牛磺酸含量；TUNEL检测心肌细胞凋亡情况；扫描电镜观察心肌组织超微结构。
　　结果：（1）高蛋氨酸组大鼠血清Hcy水平为48.76±8.33μmol/L显著高于对照组8.12±3.45μmol/L（P＜0.01），牛磺酸组血清Hcy水平为34.58±5.04μmol/L低于高蛋氨酸组（P＜0.05）。（2）高蛋氨酸组大鼠心脏功能指标LVEF及LVFS明显低于对照组（P＜0.05），牛磺酸组LVEF及LVFS明显高于高蛋氨酸组（P＜0.05）。（3）高蛋氨酸组大鼠心脏血流动力学指标LVSP及±dp/dtmax明显低于对照组（P＜0.05），LVEDP显著高于对照组（P＜0.01）；牛磺酸组LVSP及±dp/dtmax明显高于高蛋氨酸组（P＜0.05）， LVEDP明显低于高蛋氨酸组（P＜0.05）。（4）免疫组化检测结果显示，高蛋氨酸组大鼠心肌组织GRP78及CRT表达显著高于对照组（P＜0.01），牛磺酸组明显低于高蛋氨酸组（P＜0.05）；高蛋氨酸组Bcl-2及Bax表达显著高于对照组（P＜0.01），牛磺酸组Bcl-2及Bax表达分别明显低于高蛋氨酸组（P＜0.05，P＜0.01）。（5）Western blot检测结果显示，高蛋氨酸组大鼠心肌组织GRP78、CRT蛋白表达水平均明显高于对照组（P＜0.05），TAUT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及胞质内Cyt c均显著高于对照组（P＜0.01）；牛磺酸组TAUT、GRP78、CRT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3蛋白表达水平均明显低于高蛋氨酸组（P＜0.05），胞质内Cyt c蛋白表达水平显著低于高蛋氨酸组（P＜0.01）。（6）高蛋氨酸组大鼠心肌组织牛磺酸含量显著低于对照组（P＜0.01），牛磺酸组心肌组织牛磺酸含量明显高于高蛋氨酸组（P＜0.05）。（7）对照组未见TUNEL阳性染色心肌细胞核；高蛋氨酸组TUNEL阳性染色心肌细胞核数量较多；牛磺酸组TUNEL阳性染色心肌细胞核数量较少。（8）对照组大鼠心肌纤维排列整齐，线粒体形态规则；高蛋氨酸组心肌纤维排列紊乱，线粒体肿胀甚至有融合现象；牛磺酸组心肌纤维排列较整齐，线粒体肿胀甚至有融合现象明显改善。
　　结论：HHcy可诱导心肌细胞凋亡，损害大鼠心肌结构及降低心脏功能，其潜在分子机制可能与ERS及线粒体应激激活有关；牛磺酸可抑制HHcy诱导的心肌细胞凋亡，改善大鼠心肌结构与功能，其保护机制可能与缓解ERS及线粒体应激有关。
　　第二部分、细胞实验
　　Hcy诱导ERS及线粒体应激调控H9C2心肌细胞凋亡及牛磺酸干预研究
　　目的：研究Hcy对H9C2心肌细胞ERS及线粒体应激的影响，探讨ERS激活、线粒体应激及心肌细胞凋亡之间的关系；研究牛酸酸对 Hcy诱导的心肌细胞保护作用及保护机制。
　　方法：使用Hcy处理H9C2心肌细胞，观察心肌细胞ERS相关蛋白表达的变化及线粒体应激相关指标变化；使用2mM Hcy处理H9C2心肌细胞，观察细胞内Ca2+浓度变化；使用4-苯基丁酸（4-PBA）阻断ERS，观察心肌细胞凋亡率变化；使用salubrinal及si-PERK阻断PERK信号通路，观察线粒体应激相关蛋白表达、心肌细胞活力及凋亡率变化；使用牛磺酸预处理，观察心肌细胞ERS相关蛋白表达的变化及线粒体应激相关指标变化。分别使用CCK-8检测细胞活力；使用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率；使用Fluo-4,AM Ca2+荧光探针检测细胞内Ca2+浓度变化；使用JC-1检测细胞线粒体膜电位变化；使用红色线粒体内ROS探针检测线粒体内ROS水平；使用绿色胞质内ROS探针检测胞质内ROS水平变化；使用Western blot方法检测蛋白表达水平变化，使用扫描电镜观察细胞超微结构。
　　结果：（1）与对照组比较，Hcy1.0-4.0mM可显著降低心肌细胞活力，使心肌细胞活力从70.97%降低至47.54%（P＜0.01）；与对照组相比，1.0、2.0及3.0mM处理可分别导致13.7%心肌细胞凋亡（P＜0.05）、16.7%心肌细胞凋亡（P＜0.01）及20.1%心肌细胞凋亡（P＜0.01）。与对照组比较，Hcy1.0mM干预12h时H9C2心肌细胞活力明显下降（P＜0.05），干预24h及36h可导致心肌细胞活力从81.93%降低至54.55%（P＜0.01）。（2）2.0mM Hcy处理H9C2心肌细胞5min，可使细胞内Ca2+荧光强度持续增强且出现脉冲现象，单个细胞Ca2+荧光区域不断变化。（3）Hcy低浓度及短时间处理H9C2心肌细胞可使ERS应激相关蛋白GRP78、p-IER1及p-eIF2α蛋白表达升高，使ERS应激相关蛋白ATF6 p90蛋白表达降低；Hcy高浓度及长时间处理H9C2心肌细胞可使ERS应激相关蛋白GRP78、p-IER1及 p-eIF2α蛋白表达降低，使ERS应激相关蛋白ATF4、CHOP、p-JNK及cleaved caspase-12蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。（4）Hcy高浓度及长时间处理可使线粒体应激相关指标细胞线粒体膜电位逐渐降低及胞质内Cyt c浓度升高；使cleaved caspase-9及cleaved caspase-3表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；可使线粒体及胞质内ROS荧光强度明显增强。（5）通过使4-PBA干预后，Hcy诱导的H9C2心肌细胞CHOP、cleaved caspase-12及p-JNK蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），且使细胞凋亡率由11.6%降低至7.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）。（6）通过使salubrinal及si-PERK阻断PERK通路后，Hcy诱导的H9C2心肌细胞凋亡率由15.5%降低至11.7%及由16.5%降低至10.6%，差异有统计学意义（P＜0.05）。（7）通过使salubrinal阻断PERK通路后，线粒体应激相关蛋白Bcl-2/Bax蛋白表达比率显著降低（P＜0.01），cleaved caspase-3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。（8）牛磺酸预处理可使Hcy诱导的H9C2心肌细胞活力显著升高（P＜0.01），使细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）；牛磺酸预处理可升高Hcy诱导的H9C2心肌细胞线粒体膜电位，减少细胞线粒体内ROS产生；Hcy1.0mM及2.0mM处理可引起细胞内质网及线粒体肿胀，甚至导致线粒体融合及胞质内空泡形成，而牛磺酸预处理可明显改善Hcy诱导的H9C2心肌细胞内质网肿胀及线粒体融合现象。
　　结论：Hcy诱导的ERS直接调控H9C2心肌细胞凋亡，其中PERK通路在ERS调控心肌细胞凋亡过程中起重要作用。2、Hcy可诱导H9C2心肌细胞线粒体应激，引起线粒体功能障碍，导致caspase依赖的级联凋亡反应激活，可能促进了细胞凋亡事件的发生；另外，Ca2+紊乱及PERK通路可能可能是Hcy诱导的心肌细胞ERS及线粒体应激的纽带。3、牛磺酸可有效保护Hcy诱导的H9C2大鼠心肌细胞，其保护机制可能与抑制Hcy诱导的心肌细胞ERS激活及缓解Hcy诱导的心肌细胞线粒体功能障碍有关。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 高同型半胱氨酸血症（HHcy）概述

2 内质网应激（ERS）与心血管疾病

3 细胞生存与死亡的内质网-线粒体轴机制

4 牛磺酸的生理功能及心血管保护作用

实验一 HHcy诱导大鼠心肌结构及功能变化的分子机制及牛磺酸干预的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Hcy诱导ERS调控H9C2心肌细胞凋亡的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 Hcy诱导H9C2心肌细胞线粒体功能变化的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 牛磺酸保护Hcy诱导的H9C2心肌细胞的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢