CTRP9对低氧性肺动脉高压的保护作用及机制研究

摘要

背景：
　　肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）难治且预后差，可导致右心衰竭和死亡，是一种严重危害人类健康的疾病。低氧性肺动脉高压（hypoxia-induced pulmonary hypertension，HPH）是PH常见的临床类型，常见于高原、低氧环境或肺部疾病的病理状态下，由于其病生理机制复杂，尚未彻底阐明，因此，目前治疗PH的方法有限，只能达到临床缓解，不能改变患者最终需要肺移植的结局。
　　研究发现低氧刺激引起肺血管内皮损伤，可导致肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）表达分泌的多种血管活性因子、生长因子、细胞因子、炎症因子发生异常，且PMVECs活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）生成及凋亡增加。
　　C1q肿瘤坏死因子相关蛋白9（C1q/TNF-related protein9，CTRP9）是一种新发现的内源性脂肪细胞因子，在脂代谢、心血管功能等的调控中发挥重要的作用。CTRP9能够促进主动脉血管内皮产生NO，引起血管舒张，具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制内膜损伤后的血管重塑、抑制血管周围炎症和白细胞黏附等作用，对体循环动脉血管具有多重保护作用，然而，CTRP9对低氧引起的肺血管内皮功能失调有何影响，其分子机制为何，尚未见报道。因此，本研究旨在探讨CTRP9能否影响低氧引起的肺血管内皮损伤，并进一步研究其分子机制是否与影响血管活性因子及炎症因子等有关，期望为应用CTRP9缓解低氧性肺动脉高压提供实验证据，为防控低氧性肺动脉高压提供新策略和新靶点。
　　目的：
　　（1）阐明CTRP9对低氧环境PMVECs功能的影响及其分子机制。
　　（2）明确在整体水平肺组织过表达CTRP9能否改善肺血管内皮功能障碍，进而缓解HPH。
　　方法与结果：
　　（1）分离培养健康雄性SD大鼠原代PMVECs，组织块贴壁72h后倒置显微镜下从形态学上鉴定PMVECs，可见组织块周围细胞融合生长成片状的细胞单层，多角形或类圆形细胞呈铺路石样分布、细胞透亮、轮廓清晰、连接紧密，证实PMVECs培养成功。
　　（2）分离培养PMVECs，利用50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2在细胞水平复制HPH模型。实验随机分为4组，分别为：常氧组（210ml/L O2、50ml/L CO2）、低氧组（50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2）、低氧+CTRP9同时孵育组、低氧+CTRP9+Compound C孵育组（用Compound C在常氧预孵育30min后，给予CTRP9孵育的同时低氧处理），处理48h。收集细胞培养上清，分别用硝酸还原酶法、ELISA法测量NO和ET-1含量；收集细胞，抽提细胞总蛋白，用Western blot检测AMPK/p-AMPK、eNOS/p-eNOS、ERK1/2/p-ERK1/2变化。结果显示CTRP9抑制低氧时PMVECs中AMPK、eNOS磷酸化水平及NO生成的降低、ERK1/2磷酸化水平及ET-1生成的增加，该调节作用可被AMPK抑制剂Compound C抑制。
　　（3）进一步研究CTRP9对PMVECs分泌的血管活性物质NO和ET-1的影响作用及机制，培养人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs），采用慢病毒载体在基因水平干扰AMPK（Lv-PRKAA1-RNAi）后，观察CTRP9的作用。结果显示，用Lv-PRKAA1-RNAi干扰后，CTRP9在低氧条件下促进p-AMPK、p-eNOS、NO产生、抑制p-ERK1/2、ET-1生成的作用降低。
　　（4）原代培养的PMVECs分别在常氧（210ml/L O2、50ml/L CO2）、低氧（50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2）、或者低氧+CTRP9（5μg/ml）环境中孵育48h。收集细胞培养上清，ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α，提取细胞总RNA，用RT-PCR检测IL-6、TNF-αmRNA变化。结果显示：与常氧组相比，低氧处理使两种炎症因子IL-6、TNF-α在PMVECs中mRNA水平及在细胞培养上清中的含量均增加；在低氧的同时给予CTRP9孵育时，与单纯低氧组相比，两种炎症因子在PMVECs中mRNA水平及在细胞培养上清中的含量均降低。
　　（5）原代培养的PMVECs分别在常氧（210ml/L O2、50ml/L CO2）、低氧（50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2）、或者低氧+CTRP9（5μg/ml）环境中孵育48h。收集细胞，用流式法检测PMVECs中ROS含量以及凋亡率，结果显示：与常氧组相比，低氧处理使PMVECs中ROS含量及凋亡率均增加；在低氧的同时给予CTRP9孵育时，与单纯低氧组相比，PMVECs中ROS含量以及凋亡率均降低。
　　（6）将雄性SD大鼠随机分为腺相关病毒对照组（AAV-Control）和腺相关病毒CTRP9过表达组（AAV-CTRP9），每组14只，气管内注射法给予病毒载体，2周后，各组分别分为常氧组6只、低氧组8只，采用低压低氧法处理28天，建立大鼠HPH模型。在荧光显微镜下检测各组大鼠肺组织中AAV感染情况，检测各组大鼠血流动力学、右心室肥厚指标和组织病理学改变；ELISA法检测各组大鼠血清中CTRP9及ET-1的含量，硝酸还原酶法检测各组大鼠血清中NO含量。结果显示AAV成功感染各组大鼠肺组织，AAV-Control低氧处理组死亡两只，存活率75％，其余三组存活率为100%。右室收缩压、右室肥厚指数、肺血管结构在AAV-Control低氧处理组明显增加；当AAV-CTRP9过表达后再接受低氧处理，右室收缩压、右室肥厚指数明显降低，肺血管结构重构改变不明显。血清中 CTRP9、NO含量在AAV-Control低氧处理组明显降低，当AAV-CTRP9过表达后再接受低氧处理，二者血清含量又明显升高。血清中ET-1含量在AAV-Control低氧处理组明显升高，当AAV-CTRP9过表达后再接受低氧处理，血清含量又明显降低。
　　结论：
　　在低氧环境中，CTRP9通过激活AMPK恢复eNOS/NO与ERK1/2/ET-1两条信号通路平衡而显著改善肺血管内皮功能，同时抗炎、抗氧化应激以及抗凋亡效应可能也发挥了保护肺血管内皮的作用；整体过表达肺组织CTRP9可通过改善肺血管内皮功能延缓HPH进展及右心室重塑。本研究为深入认识HPH的分子病因学机制和应用CTRP9防控HPH提供了实验证据。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、肺动脉高压的概念、诊断标准与分类

二、低氧性肺动脉高压

三、肺动脉高压与低氧性肺动脉高压的治疗

四、CTRP9研究进展

第一部分 CTRP9对低氧时PMVECs的保护作用及机制

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 腺相关病毒在体过表达CTRP9在HPH中的保护作用研究

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

本课题创新点与特色

参考文献

个人简历和研究成果

致谢