斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用。本发明首次克隆获得斜带石斑鱼gctrp9基因，并将该基因构建表达载体和重组酵母菌株，利用重组酵母菌种在体外获得大量表达的斜带石斑鱼gctrp9蛋白，该蛋白可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用，所述应用为在制备促生长剂或饲料添加剂中的应用。 

背景技术

脂肪作为动物贮存能量的组织，在调节和控制机体的代谢中起着重要的作用，它能分泌多种具有生物活性的细胞因子。在哺乳类动物中脂联素（Adiponectin）是一种由脂肪细胞分泌的细胞因子蛋白，主要参与调节葡萄糖水平和脂肪的降解，其次还包括抗炎、抗动脉粥样硬化、促血管形成因子和抗血管形成因子的特性。ctrp9是与adiponectin同源性最近的CTRP家族的成员，由四个区域，第一个区域为信号肽；第二个区域为可变区；第三个区域为胶原蛋白的相似区；最后一个区域为球状区，也为功能区。最近研究表明，ctrp9与adiponectin有相同的功能，参与调节葡萄糖水平和脂肪的降解，还有参与摄食、抗炎作用、免疫反应的功能，并且有实验证明CTRP9可能通过与AdipoR1结合，增加AMPK/Akt/eNOS磷酸化，增加血管活性。 

石斑鱼属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，为暖水性的大中型海产鱼类。石斑鱼营养丰富，肉质细嫩洁白，类似鸡肉，素有“海鸡肉”之称。石斑鱼又是一种低脂肪、高蛋白的上等食用鱼，被港澳地区推为我国四大名鱼之一，是高档筵席必备之佳肴。目前石斑鱼的饲料还是以动植物蛋白作为主要添加剂，然而动植物蛋白成本较高，如果能够提高石斑鱼对糖脂的利用，对生产成本会有很大的降低，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进糖脂利用的饵料添加剂。 

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种斜带石斑鱼ctrp9基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。 

本发明的另一目的在于提供一种含有斜带石斑鱼gctrp9基因的表达载体； 

本发明的另一目的在于提供上述载体转化的酵母菌株；

本发明的另一目的在于提供了利用上述酵母重组酵母菌株得到重组斜带石斑鱼gCTRP9的方法。

本发明的另一目的在于提供上述基因在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。

本发明克隆了斜带石斑鱼的ctrp9基因，并得到了3’UTR和部分5’UTR。克隆的方法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的基因比对设计简并引物，经过PCR后得到中间片段，然后根据中间片段的序列分别设计两个5’RACE的下游引物和两个3’RACE的上游引物，在利用通用引物AAP和AUAP进行5’和3’嵌套PCR得到了ctrp9的ORF、5’UTR和3’UTR。最后设计克隆ORF的引物，PCR后把得到目的基因连接到PCR2.1载体为PCR2.1-ctrp9。 

本发明构建了含有斜带石斑鱼gCTRP9的毕赤酵母表达载体。这个载体的构建方法是按常规方法，利用自己所构建的载体PCR2.1- ctrp9为模板，通过PCR方法合成带有酶切接头的斜带石斑鱼gctrp9基因，经酶切和分离纯化后，接入到已有的载体pPICZaA的相应酶切位点（即EcoRI-HF和NotI）之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼gctrp9基因的表达载体pPICZaA- gctrp9。 

本发明还用上述含有斜带石斑鱼gctrp9基因的相应表达载体构建了能高效表达斜带石斑鱼gctrp9基因的酵母重组株。 

本发明的上述能表达斜带石斑鱼gCTRP9酵母重组菌株优先由含有斜带石斑鱼gctrp9基因的表达载体pPICZaA- gctrp9转化毕赤酵母X33而得到的菌株，命名为pPICZaA- gctrp9- X33。 

本发明还提供了利用上述毕赤酵母重组株生产斜带石斑鱼gCTRP9的方法。先将菌种接种在含有BMGY的液体培养基中，28℃，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌体并重悬菌体于BMMY液体培养基中，并加入吐温-80，使其终浓度为0.4%，28℃，200转/分培养，18-24小时后向培养液中加入甲醇，使终浓度为0.5%，然后28℃，200转/分培养，18-24小时后收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼gCTRP9产品 

斜带石斑鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的石斑鱼gctrp9基因重组株pPICZaA- gctrp9- X33，生产重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白，并可进一步用作制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

本发明首次克隆获得斜带石斑鱼gctrp9基因，并将该基因构建表达载体和重组酵母菌株，利用重组酵母菌种在体外获得大量表达的斜带石斑鱼gCTRP9蛋白，该蛋白可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。

附图说明

图1.以斜带石斑鱼肝脏的反转录cDNA为模板进行PCR扩增ctrp9中间片段产物的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；NC：阴性对照。 

图2.5’RACE和3’RACE的PCR电泳图；A是5’RACE第一轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1、2、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照；B是5’RACE第二轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1、2、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照；C是3’RACE第一轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1、2、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照；D是3’RACE第二轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1、2、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照；E是克隆ctrp9 ORF的产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1、2、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照。 

图3；A是带酶切位点gctrp9的PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1、2 、3：PCR扩增产物；NC：阴性对照；B是重组质粒pPICZaA-gctrp9的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pPICZaA-gctrp9EcoRI-HF和NotI双酶切；2：pPICZaA-gctrp9未酶切。 

图4；A是重组株pPICZaA-gctrp9-X33表达产物gCTRP9的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker； NC：阴性对照；1：重组株pPICZaA-gctrp9-X33表达产物；B和C是重组株pPICZaA-gctrp9-X33表达产物gCTRP9纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图及Western blot鉴定图谱；其中，M：蛋白Marker；1、2、3、4：SDS-PAGE；5、6、7、8：Western blot； NC：阴性对照。 

图5是重组斜带石斑鱼gCTRP9对斜带石斑鱼原代肝细胞葡萄糖产出的影响；其中“**”表示与对照组相比有显著性差异，P＜0.01。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。 

实施例1：ctrp 9基因中间片段的克隆

对已报道的红鳍东方鲀（takifugu rubripes），青斑河豚（tetraodon nigroviridis），三刺鱼（gasterosteus aculeatus），青鳉（oryzias latipes）中所获得的 ctrp9 序列进行比对，找到相对保守区域，设计克隆斜带石斑鱼 ctrp9 序列中间片段的一对简并引物，上游引物为5`CCHGGRAAAATGGGVCCCCA 3`，下游引物为5`AAGACRGTGATGTGRTAGGTRAAG 3`；以斜带石斑鱼肝脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃∞。PCR反应后的凝胶电泳图见图1。

实施例2：ctrp 9基因 5’RACE和3’RACE

根据已经获得的中间片段序列分别设计5’RACE和3’RACE各两条引物并利用通用引物AUAP和AAP。

5’RACE上游引物为： 

AAP：5' GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3'、

下游引物分别为：

R1：5'TAGGGAGTTTACTTTGTGCTGTGAG 3'；

R2：5'ATATTGCCTTTGTGACCTGGAAC3'；

3’RACE上游引物分别为:

F1：5'GAAGTTGGCCTTAGAGGTGACAGA 3'；

F2：5'CTCACAGCACAAAGTAAACTCCCTA 3'；

下游引物为AUAP：5' GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3'。

以斜带石斑鱼肾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，65 ℃ 15s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃ ∞。PCR反应后的凝胶电泳图见图2中的A、B、C、D。 

实施例3：ctrp 9  ORF的克隆

根据实施例1和实施例2的结果，设计一对克隆ctrp9 ORF的引物，上游引物F-ORF的核苷酸序列为5'TTTTGCATTGTTGATAGATAGG3'、下游引物R-ORF的核苷酸序列为5'AGACAGGCTGATTTCTTATGAC3'，以斜带石斑鱼肾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s， 59 ℃ 15s，72 ℃ 80 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃∞。经过PCR后把得到的产物与PCR2.1载体连接在一起为PCR2.1-ctrp9。PCR反应后的凝胶电泳图见图2中的E。

实施例4：带酶切位点的斜带石斑鱼gctrp9基因合成

根据自己克隆到的斜带石斑鱼ctrp9基因的序列及限制性内切酶EcoRI-HF和NotI的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为 5’CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCTTGTTATCTCTAAAAGCG3’是在gctrp9基因的成熟肽序列前添加了EcoRI-HF酶切识别位点和6Xhis标签，下游引物R为 5’ATAGTTTAGCGGCCGCCTAAGCCCCAAAGATTA3’是在gctrp9基因成熟肽序列后添加了终止密码子及NotI酶切识别位点。利用自己构建的PCR2.1-ctrp9为模板进行PCR反应，PCR反应条件为： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s， 64 ℃ 30s，72 ℃  40 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃∞。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3中A。

实施例5：含斜带石斑鱼gctrp9基因的毕赤酵母表达载体pPICZaA- gctrp9的构建

PCR产物用限制性内切酶EcoRI-HF和NotI双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化斜带石斑鱼gctrp9基因片段；载体质粒pPICZaA经限制性内切酶EcoRI-HF和NotI双酶切后分离纯化，与分离纯化斜带石斑鱼gctrp9基因片段混合，用TOYOBO Ligtion High连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶EcoRI-HF和NotI双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与斜带石斑鱼gctrp9基因和表达载体pPICZaA大小相同，证明斜带石斑鱼gctrp9基因已克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaA中，重组质粒命名为pPICZaA- gctrp9。酶切分析图分别见图3中的B。

实施例6：能高效表达斜带石斑鱼gCTRP9的毕赤酵母重组株pPICZaA-gctrp9-X33的构建

按照invitrogen公司的The EasyselectTM Pichia Expression Kit说明书制备毕赤酵母X33感受态细胞，重组质粒pPICZaA- gctrp9用PmeI 线形化后凝胶回收，用标准方法电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，在含Zeocin 500ug/ml的YPDS平板上28℃进行培养。约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼gCTRP9的毕赤酵母重组株pPICZaA-gctrp9-X33。

实施例7：利用毕赤酵母基因工程菌pPICZaA-gctrp9-X33生产重组斜带石斑鱼gCTRP9

挑取毕赤酵母工程菌pPICZaA-gctrp9-X33单菌落接种在10ml BMGY液体培养基中，28℃，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌体并重悬菌体于100mlBMGY液体培养基中，28℃，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌体并重悬菌体于100mlBMMY液体培养基中，并加入吐温-80，使其终浓度为0.4%， 28℃，200转/分培养，18-24小时后向培养液中加入甲醇，使终浓度为0.5%，然后28℃，200转/分培养，18-24小时后收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼gCTRP9产品。取1ml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZaA转化X33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图4中的A。pPICZaA-gctrp9-X33表达上清用Novagen公司的His-bind Resin进行纯化处理，结果见图4中的B。

将重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白采用免疫印迹（Western blot）方法进行鉴定。一抗为s鼠抗HIS单克隆抗体（购自Novagen公司），二抗为羊抗鼠IgG-HRP（购自博士德生物工程有限公司）。结果见图4中的C。 

实施例8：重组斜带石斑鱼gCTRP9的功能研究-对斜带石斑鱼原代肝细胞葡萄糖产出的影响

分离斜带石斑鱼原代肝细胞后，用加入10%FBS的含有酚红的L15培养基把细胞浓度调成5×105细胞/mL，然后在24孔板中每孔加入1mL，放在25℃的生化培养箱中，培养4h后，换成900μL的无FBS和酚红的L15培养基过夜，第二天向处理组中每孔加入100μL的浓度为100μg/mL的分离纯化后的重组斜带石斑鱼gCTRP9，对照组加入等体积的PBS，分别在6和12h收取培养上清并用细胞裂解液（购自ThermoFisher Scientific公司）裂解细胞后完全收取裂解细胞后的裂解液。用BCA（购自碧云天公司）法测量裂解液中的总蛋白浓度，培养上清浓缩（冻干再溶水）后用葡萄糖测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测量葡萄糖浓度。以每孔中的总蛋白浓度作为内参，比较对照组和处理组之间葡萄糖浓度的变化情况。结果显示，在6h时，处理组葡萄糖浓度比对照组有下降趋势，但在12h后处理组葡萄糖浓度明显低于对照组。结果如图5。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中山大学

 

<120>  斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用

 

<130> 

 

<160>  14   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1020

<212>  DNA

<213>  ctrp9基因序列

 

<400>  1

atgctgcgga tgaggtttag tgtcattctc ttgctccttc tattggcagt caggtgtgtt     60

 

acacaggaag taaccccaaa caaagactgc gtttgtggac atcctggtat acctggggac    120

 

cccggacaca atggcacacc tggcagagat ggccgagatg gactcagagg tgaaaaaggt    180

 

gatcaaggtc aagttggccc agttggagca gctggcaatg atggccacag aggagacaaa    240

 

ggggaacctg gtgcagttgg tccagcaggg ctcaaaggaa aaaggggaga aaatggcgaa    300

 

cgggggcctc ctgggaaaat ggggccccaa ggagtccaag ggcccattgg actcaaagga    360

 

agtaagggag atcttgggct gcctggaccc caaggaccta aaggggattt ggggcctctt    420

 

ggaccacagg gtcccaaggg agaagttggc cttagaggtg acagaggcat tcaggggcca    480

 

ctgggacccc ctggcaggcc agggcccaag ggggaaattg gtgttccagg tcacaaaggc    540

 

aatattggtt atcgtgggga gagagggtct cgaggagaga aaggtgacaa aggtgagaag    600

 

ggagaagaac ttgttatctc taaaagcgcc ttctcagtgg gactcacagc acaaagtaaa    660

 

ctccctacac ctaatgctcc gatccggttt gacaagatca tttacaatgt gcagaatcac    720

 

tacgatccac agacaggaag attcacatgc tccgcagcgg gagcatattt cttcacctac    780

 

cacatcacag tcttctcccg gaacgtgaag gttgctctgg tgaagaatgg tgcaaagatc    840

 

attcacacca cggataacta ccagagcagc gaggatcagg cagcaggggg cgctgtgctg    900

 

aacctggatg tgggagacaa ggtgtggctg caggtgactg ggggagagct gtacaatggg    960

 

ctctttgctg atgaagatga tgacacgacc ttctctgggt tcttaatctt tggggcttag   1020

 

 

<210>  2

<211>  339

<212>  PRT

<213>  ctrp9蛋白序列

 

<400>  2

 

Met Leu Arg Met Arg Phe Ser Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Val Arg Cys Val Thr Gln Glu Val Thr Pro Asn Lys Asp Cys Val Cys

            20                  25                  30         

 

 

Gly His Pro Gly Ile Pro Gly Asp Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly

        35                  40                  45             

 

 

Arg Asp Gly Arg Asp Gly Leu Arg Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Val Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Asn Asp Gly His Arg Gly Asp Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Glu Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly

                85                  90                  95     

 

 

Glu Asn Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Lys Met Gly Pro Gln Gly Val

            100                 105                 110        

 

 

Gln Gly Pro Ile Gly Leu Lys Gly Ser Lys Gly Asp Leu Gly Leu Pro

        115                 120                 125            

 

 

Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Leu Gly Pro Leu Gly Pro Gln Gly

    130                 135                 140                

 

 

Pro Lys Gly Glu Val Gly Leu Arg Gly Asp Arg Gly Ile Gln Gly Pro

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly Val Pro

                165                 170                 175    

 

 

Gly His Lys Gly Asn Ile Gly Tyr Arg Gly Glu Arg Gly Ser Arg Gly

            180                 185                 190        

 

 

Glu Lys Gly Asp Lys Gly Glu Lys Gly Glu Glu Leu Val Ile Ser Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Thr Ala Gln Ser Lys Leu Pro Thr Pro

    210                 215                 220                

 

 

Asn Ala Pro Ile Arg Phe Asp Lys Ile Ile Tyr Asn Val Gln Asn His

225                 230                 235                 240

 

 

Tyr Asp Pro Gln Thr Gly Arg Phe Thr Cys Ser Ala Ala Gly Ala Tyr

                245                 250                 255    

 

 

Phe Phe Thr Tyr His Ile Thr Val Phe Ser Arg Asn Val Lys Val Ala

            260                 265                 270        

 

 

Leu Val Lys Asn Gly Ala Lys Ile Ile His Thr Thr Asp Asn Tyr Gln

        275                 280                 285            

 

 

Ser Ser Glu Asp Gln Ala Ala Gly Gly Ala Val Leu Asn Leu Asp Val

    290                 295                 300                

 

 

Gly Asp Lys Val Trp Leu Gln Val Thr Gly Gly Glu Leu Tyr Asn Gly

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Phe Ala Asp Glu Asp Asp Asp Thr Thr Phe Ser Gly Phe Leu Ile

                325                 330                 335    

 

 

Phe Gly Ala

           

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  简并引物的上游引物

 

<400>  3

cchggraaaa tgggvcccca                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  简并引物的下游引物

 

<400>  4

aagacrgtga tgtgrtaggt raag                                            24

 

 

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  AAP

 

<400>  5

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg                                      30

 

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  R1

 

<400>  6

tagggagttt actttgtgct gtgag                                           25

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  R2

 

<400>  7

atattgcctt tgtgacctgg aac                                             23

 

 

<210>  8

<211>  24

<212>  DNA

<213>  F1

 

<400>  8

gaagttggcc ttagaggtga caga                                            24

 

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  F2

 

<400>  9

ctcacagcac aaagtaaact cccta                                           25

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  AUAP

 

<400>  10

ggccacgcgt cgactagtac                                                 20

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  F-OR

 

<400>  11

ttttgcattg ttgatagata gg                                              22

 

 

<210>  12

<211>  22

<212>  DNA

<213>  R-ORF

 

<400>  12

agacaggctg atttcttatg ac                                              22

 

 

<210>  13

<211>  45

<212>  DNA

<213>  F

 

<400>  13

cggaattcca tcatcatcat catcatcttg ttatctctaa aagcg                     45

 

 

<210>  14

<211>  33

<212>  DNA

<213>  R

 

<400>  14

atagtttagc ggccgcctaa gccccaaaga tta                                  33