感觉神经调控大鼠牙发育内稳态的机制研究

摘要

内稳态（homeostasis）[1]即内环境的稳态，早期特指机体内环境的理化性质处于动态平衡的状态，如细胞外液、组织液、血液和淋巴的量在机体中处于相对恒定的状态。随着生命科学的发展，内稳态的概念得到了扩展，可以指机体、器官、组织以及细胞通过神经-体液-免疫系统共同作用，保持各种生理过程处于协调和稳定的状态。在组织和器官发育和维持内稳态（homeostasis）的过程中，干细胞（stem cells）能够通过动态调整其增殖和分化，形成高度精确的复杂结构，如表皮、血液和小肠上皮中的干细胞能够不断分化出新的细胞，补充在正常组织更新（tissue turnover）中损失的细胞，这一过程称为维持组织或器官的内稳态。牙齿的形态发生和生长发育是神经嵴源性上皮与外胚间充质相互作用的结果[2]，其发育模式（patterning）[3]在牙胚发育启动时期已经确定，因此牙胚是一个相对独立的发育单元，其内稳态的调控机制近年来逐渐成为口腔研究学者的关注热点。最近的一些研究发现[4]牙胚发育早期，神经源性信号分子可以调控间充质干细胞的增殖、迁移及分化；此外还发现[5]，神经相关的胶质细胞不仅能够定向分化为牙髓和成牙本质细胞，还在下切牙的损伤修复过程中发挥了重要作用。然而神经在维持牙齿发育内稳态的具体作用尚不甚清楚。啮齿动物的下颌切牙根尖区上皮和间充质细胞不断进行更新，使下切牙能够终身不断生长，是研究牙齿内稳态的理想模型[6,7]。大量处于休眠期的上皮源性干细胞位于下切牙根颈环部分根尖蕾（apical bud）中；而间充质来源的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）则主要分布在牙髓组织中[8]。大鼠下切牙主要受感觉神经纤维——下牙槽神经(IAN)，和交感神经纤维——颈上神经节(SCG)发出的节后纤维支配[9,10]。因此，明确哪类神经在牙发育中起主要支配作用将有助于我们更好的理解感觉神经和交感神经在维持内稳态和组织再生修复中的作用，目前未见明确的神经调控牙齿内稳态相关机制的报道。本研究拟通过建立单侧大鼠下切牙失感觉和失交感神经模型，观察牙的形态和组织学变化，进而检测失神经后大鼠牙髓干细胞的生物学行为，以期明确神经能够通过调控间充质干细胞的行为影响下切牙的内稳态，进而分析神经维持牙齿内稳态的相关信号通路，探讨神经调控牙内稳态的分子机制，以期为研究神经维持组织器官内稳态的作用模式提供研究基础和实验依据。
　　第一部分失神经大鼠模型下切牙的形态组织学检测实验研究
　　目的：明确感觉神经和交感神经在维持大鼠下切牙内稳态中的作用。方法：建立失右侧感觉神经(IANx)模型，失右侧交感神经（SCGx）模型和失右侧感觉和交感神经（IANx+SCGx）模型，同时设立假手术（Sham）组，2周后观察下切牙形态学变化， Micro-CT和组织学染色检测下切牙结构变化。结果：成功建立失感觉神经模型（截断下牙槽神经）和失交感神经模型（以上睑下垂作为手术成功指征）；2周后， IANx组和IANx+SCGx组失神经侧下切牙发生明显不透光的白垩色改变；Micro-CT检测显示，与Sham组相比，IANx组和IANx+SCGx组下切牙髓腔中出现团块状不规则高密度影，釉质和牙本质厚度均减少（P＜0.01），两组间无统计学差异，而SCGx组无明显变化；HE和Masson染色显示IANx组和IANx+SCGx组右侧下切牙牙髓-牙本质复合体结构紊乱，髓腔内出现髓石，成牙本质细胞出现变性坏死，同时釉质和牙本质形成不全，两组间无统计学差异，SCGx组与Sham组无明显差异；免疫组化染色显示IANx组和IANx+SCGx组下切牙生发中心-根尖蕾结构中Pcna表达显著减弱，此外，免疫组化和免疫荧光染色显示，成牙本质细胞层 Dsp表达明显降低，而 SCGx组无明显变化。结论：截断感觉神经可以明显影响牙齿形态结构的形成，提示感觉神经在大鼠下切牙生长发育内稳态维持中发挥了主要作用，而交感神经无明显作用。
　　第二部分感觉神经维持大鼠牙髓干细胞生物学性能的实验研究
　　目的：检测及分析失感觉神经后大鼠牙髓干细胞rDPSCs的生物学性能。方法：分别分离和培养失感觉神经(IANx)2周后的 rDPSCs和假手术（Sham）2周后的rDPSCs，采用流式细胞仪和细胞免疫荧光检测干细胞表面分子标记物；计算克隆形成率比较克隆形成能力，CCK-8检测细胞增殖能力；进行成骨、成脂的观察和定量分析，同时通过qRT-PCR比较两种细胞成骨、成脂分化相关基因的表达水平；使用细胞凋亡试剂盒检测两组细胞的细胞凋亡率。结果：分离培养的IANx组和Sham组rDPSCs能够阳性表达MSC的标记物CD105和CD29，而不表达造血干细胞标记物CD45，此外还表达神经源性标记物GFAP；IANx组和Sham组rDPSCs均具有克隆形成能力和增殖能力，但IANx组rDPSCs的克隆形成率（8.61±0.62％）远低于Sham组（16.22±0.49%）（P＜0.05），且增殖能力弱于Sham组（P＜0.05）；IANx组和Sham组rDPSCs都具有向成骨细胞和成脂细胞分化的能力，Sham组rDPSCs的成骨成脂能力均显著高于IANx组（P＜0.05）；检测IANx组rDPSCs的细胞凋亡率（11.35±0.93%）明显高于Sham组（6.22±1.05%）（P＜0.001）。结论：IANx组和Sham组rDPSCs均具有间充质干细胞的自我更新和多向分化能力，但IANx组rDPSCs的生物学性能明显受损，提示感觉神经在维持rDPSCs的正常生物学行为中发挥了重要作用，且这种作用不受细胞传代的影响。
　　第三部分感觉神经维持大鼠牙髓干细胞生物学性能的相关Wnt/β-Catenin信号通路机制的实验研究
　　目的：探讨Wnt/β-Catenin信号通路在rDPSCs生物学行为中的作用，以期明确感觉神经维持大鼠下切牙内稳态中的具体机制。方法：qRT-PCR检测第二部分IANx组和Sham组rDPSCs中Wnt/β-Catenin信号通路相关分子β-Catenin、Gsk-3β、Dkk1、Lrp5、Sfrp1和Wnt10a的基因表达水平；Western Blot检测两组细胞Wnt/β-Catenin信号通路关键蛋白β-Catenin和Gsk-3β蛋白的表达水平；设置假手术组（Sham组）、失感觉神经组（IANx组）和失感觉神经组+激活剂氯化锂（LiCl）组（IANx+ LiCl组），qRT-PCR和Western Blot检测各组细胞Wnt/β-Catenin信号通路的表达水平；培养液中添加激动剂LiCl，激活失感觉神经rDPSCs的Wnt/β-Catenin信号通路后，检测其克隆形成能力、增殖能力、多向分化能力和细胞凋亡水平，并与IANx组和Sham组进行比较。结果：qRT-PCR结果显示，较Sham组rDPSCs，IANx组中Wnt10a表达量降低，抑制分子Dkk1的表达水平明显升高，关键分子β-Catenin和Gsk-3β的基因表达量均无明显差异；Western Blot检测示，较Sham组rDPSCs，IANx组中关键分子active-β-Catenin和p-Gsk-3β的蛋白表达量均降低，但总蛋白量无明显差异，提示失感觉神经后，rDPSCs的Wnt/β-Catenin信号通路受到抑制；qRT-PCR和Western Blot结果表明，LiCl处理后能激活细胞的Wnt/β-Catenin信号通路，但尚不能使之恢复至正常水平；IANx+ LiCl组的克隆形成率（13.49±1.16%）明显升高，介于Sham组（16.22±0.86%）和IANx组（8.62±1.07%）之间（P＜0.05），增殖能力和成骨成脂分化能力均有一定程度回升（P＜0.05），同时，细胞凋亡率（8.29±0.94%）较 IANx组（11.35±0.93%）而言明显降低（P＜0.05），但仍高于Sham组（5.88±0.47%）（P＜0.05）。结论：感觉神经可能通过Wnt/β-Catenin信号通路维持rDPSCs的生物学行为。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、神经在形态发生中的研究进展

二、神经在再生修复中的作用

三、神经对啮齿类动物下切牙生长发育的调控作用

四、牙齿发育中的分子信号通路

第一部分 失神经大鼠模型下切牙的形态组织学检测实验研究

1 材料

2方法

3 结果

4讨论

第二部分 感觉神经维持大鼠牙髓干细胞生物学性能的实验研究

1 材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 感觉神经维持大鼠牙髓干细胞生物学性能的相关Wnt/β-Catenin信号通路机制的实验研究

1 材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢