保元解郁方对模拟航天郁证的防治效果及作用机制研究

摘要

研究背景:在中长期航天飞行中，航天员面临特殊而又复杂的极端环境，遭受微重力、噪声、昼夜节律改变、狭小环境、社会隔离、辐射等特殊环境因素影响。航天应激环境给乘员的心理带来极大的挑战，容易引起睡眠障碍、疲劳、易怒、情绪不稳定、注意力难以集中、焦躁不安、心悸、血压不稳、食欲缺乏等心身症状和认知变化，影响工作效率和表现，载人航天史中不乏因为心理问题影响工作甚至提前返回的案例。这些心身症状符合中医郁证的临床特征，为了区别于一般临床上的郁证，我们将其称为航天郁证。
　　中长期航天飞行应激因素多，心理问题机制复杂，涉及多系统结构和功能异常或紊乱，针对单一靶点的防治措施很难取得满意的疗效。中医药具有多系统、多层次、多靶点对机体功能进行调节和不良反应少的优点，应用于航天领域有其独特的优势。本团队长期从事航天员医监医保任务和实践，一直致力于中医药在载人航天中的应用研究。保元解郁方（BYJYF）是根据空间站任务医学需求，针对长期航天飞行心理应激问题，结合航天员医学监督和保障的长期实践，借鉴古今名医用药经验，参考现代药理学研究成果，以疏肝解郁、养血理气、安神宁志为组方原则，拟定出的防治航天郁证的中药复方。然而此方对抗航天郁证的作用及其机制尚未完全阐明，本研究以此为切入点，塑造航天复合应激大鼠模型，采用多种方法揭示BYJYF水提物在多个系统和层次上的抗郁效果，深入探讨其作用机制。
　　研究目的和意义:
　　1.创建航天郁证大鼠模型，评价其行为学表现和各系统变化，为研究载人航天飞行任务中的郁证问题提供技术平台。
　　2.阐释航天郁证的发生机制和病理基础，为其防治提供理论支持。
　　3.评价保元解郁方对模拟航天郁证的干预效果，从神经、内分泌、氧化应激等不同方面揭示其对抗航天郁证的作用环节，深入研究其潜在干预机制，探讨作用通路和靶点，为中医药防治航天郁证和航天新药开发提供理论和实验依据。
　　研究方法:利用神经行为学方法、生化检测、酶联免疫吸附试验、高效液相色谱串联质谱、病理切片、抗体芯片、蛋白免疫印迹、网络药理学分析等手段，从动物行为表现、整体应激水平和抗氧化水平、脑神经递质、组织形态、蛋白分子、信号转导通路多层面探讨模拟航天郁证的病理基础，阐释BYJYF干预航天郁证的作用及其机制。
　　1.动物分为空白组（Ctrl）、模型组（Mod）、BYJYF组、盐酸氟西汀组（Flu）。通过尾吊、孤养、65dB(A)噪声暴露、90分钟明暗周期设置等方法，模拟失重、隔离、噪声、昼夜节律改变等多因素组成的航天复合应激。经过42天模拟航天复合应激和灌胃给药后，应用糖水偏好实验、旷场实验、Morris水迷宫实验、强迫游泳实验等四个行为学方法评价大鼠模型的抑郁样行为，用盐酸氟西汀做阳性对照药物，对BYJYF的三个剂量组进行药效验证。
　　2.应用酶联免疫吸附试验检测血清应激激素CORT、ACTH、NE、DA水平，观察模拟航天郁证应激水平的变化和BYJYF对应激水平的影响。
　　3.用水溶性四唑盐法、可见光分光光度法、化学比色法和硫代巴比妥酸法分别检测血浆氧化还原酶SOD、CAT、T-AOC活性和脂质过氧化产物MDA的水平，观察模拟航天郁证大鼠氧化应激水平的变化和BYJYF对氧化应激水平的影响。
　　4.应用高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定大鼠海马和大脑皮层组织中7种主要神经递质 E、NE、DA、5-HT、GABA、Glu、Ach的水平，观察模拟航天郁证大鼠神经递质水平的变化和BYJYF对脑组织神经递质水平的影响。
　　5.通过对大脑组织切片进行尼氏染色，观察海马和大脑皮层组织神经元数量和形态的变化，评价模拟航天郁证和BYJYF对神经元组织形态的影响。
　　6.应用 KAM-850抗体芯片进行海马和大脑皮层组织高通量蛋白组学检测，分析差异蛋白，找出其对应的基因，运用KEGG数据库进行通路富集分析，获取差异表达基因显著富集的通路，初步探讨BYJYF的作用通路和靶标蛋白。
　　7.按照通路功能对芯片富集结果做进一步分析，找出与神经系统密切相关的通路，用免疫印迹法对海马和大脑皮层匀浆进行检测，观察相关通路上关键蛋白的表达水平变化，对抗体芯片的结果进行验证，揭示BYJYF的作用通路和靶标蛋白。
　　8.检索BYJYF所含化学物质，应用药物CIPHER-CS方法进行网络药理学分析，预测潜在靶标并找出相应的基因，对基因进行GO功能分析和KEGG通路分析，从组分角度预测BYJYF的作用靶标，与动物实验结果进行比较和汇总分析，进一步明确BYJYF的作用机制。
　　研究结果:
　　1.采用四个因素模拟长期航天复合应激，引起大鼠糖水偏好率降低，旷场运动平均速度降低，MWM定位航行实验逃避潜伏期和游程延长，MWM空间搜索实验原平台象限的游泳时间百分比明显减少，强迫游泳不动时间和攀爬次数减少。航天郁证模型大鼠具有快感缺失、情绪低落、行为绝望、学习记忆能力下降等抑郁样反应和认知下降表现。BYJYF能够减轻抑郁样反应发生程度，增强学习记忆能力，具有剂量-效应关系，效果不亚于盐酸氟西汀。
　　2.航天郁证模型大鼠血清NE、DA、CORT、ACTH水平和MDA水平升高，SOD、CAT、T-AOC活性降低，交感神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴活性以及氧化应激水平增加。BYJYF可以防止或减轻这些指标的变化，降低应激反应水平，减轻氧化应激损伤。
　　3.航天郁证模型大鼠大脑皮层神经递质NE、E、DA、5-HT和GABA的含量和海马NE和5-HT的含量减少，大脑皮层Glu、Ach的含量和海马Ach的含量增加。BYJYF对大脑皮层和海马多种神经递质水平有调节作用。
　　4.航天郁证模型大鼠海马CA3区和大脑皮层神经元数量减少，间隙变大，排列稀疏散乱，染色变弱，尼氏体减少。BYJYF可以有效减轻海马和皮层神经元数目和形态的改变，减轻神经元损伤，对神经元有保护作用。
　　5.在854个蛋白分子中，海马组织中Mod组和BYJYF组显著差异蛋白分别是51个和37个，集中于MAPK、mTOR、神经营养因子和p53等信号传导通路；大脑皮层组织中分别是28个和43个，集中于MAPK、p53、神经营养因子、mTOR等信号传导通路。Mod组 MAPK和 p53通路在海马和大脑皮层中活性变化都很明显；BYJYF组MAPK、神经营养因子和mTOR通路活性在海马和大脑皮层中都发生了明显变化。其中MAPK和神经营养因子通路与神经系统功能密切相关。
　　6. MAPK通路上的关键蛋白变化：1）海马组织：航天郁证模型p-ERK1/2和p-p38 MAPK蛋白水平均升高，BYJYF可使其水平降低。2）大脑皮层组织：BYJYF组ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平升高。结果提示，模拟航天郁证ERK和p38 MAPK通路上调，BYJYF下调了海马ERK和p38 MAPK通路，对皮层的影响有待进一步验证。
　　7.神经营养因子通路上的关键蛋白变化：1）海马组织：航天郁证模型p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-CREB、BDNF水平显著降低，p-GSK-3β水平显著升高；BYJYF可明显减轻这些蛋白水平的变化幅度。2）大脑皮层组织：航天郁证模型p-CREB没有明显变化；BYJYF组p-CREB水平有所升高，其他蛋白变化趋势与海马组织一致。结果提示，模拟航天郁证神经营养因子通路下调，BYJYF可以上调大脑皮层和海马神经营养因子通路。
　　8.共收集到BYJYF八味中药所含的814个小分子化合物，包括水溶性成分412个，得到588个潜在靶标蛋白。KEGG通路分析发现，在17类通路中，神经活性配体受体相互作用通路、血管平滑肌收缩相关通路、钙信号通路与神经功能或应激密切相关。GO功能注释分析中，细胞信息传递、细胞膜、离子通道等功能富集区也与神经系统密切相关。
　　结论:
　　1.尾吊、孤养、65dB(A)噪声暴露、90分钟明暗周期更替等四个因素叠加模拟长期航天复合应激能够诱导大鼠抑郁样反应，此方法可以成功构建航天郁证模型。
　　2.模拟航天郁证大鼠具有抑郁样反应和认知功能下降表现，应激反应和氧化应激明显，神经递质水平失调，大脑皮层和海马CA3区神经元损伤。模拟航天郁证与神经和内分泌、氧化还原和神经递质水平失调，以及神经元损伤相关。
　　3. BYJYF能够减轻交感神经系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活和机体氧化应激损伤，调节脑神经递质水平，减轻神经元损伤，通过调节神经和内分泌、抗氧化、调节神经递质和保护神经元等多种途径减轻抑郁样反应、改善认知，对抗模拟航天郁证作用明显。
　　4. BYJYF可通过下调 MAPK通路和上调神经营养因子通路，提高大脑 BDNF水平并激活 CREB来改善神经可塑性，减轻应激和炎性反应，减少神经元凋亡，促进神经元存活，从而保护神经元，对抗航天郁证。
　　5.针对航天郁证多系统的病理生理改变进行中医辩证，依据疏肝解郁、养血理气、安神宁志的治则拟定的保元解郁方具有多系统、多靶点、多途径整体综合调理的效用优势，辨证合理，组方科学，疗效显著，具有很好的研发和应用前景。
　　创新点:
　　1.首次通过尾吊、孤养、65dB(A)噪声暴露、90分钟明暗周期设置等方法建立航天郁证动物模型，此模型将为研究载人航天飞行中的郁证问题提供技术平台和理论支持。
　　2.首次从神经行为学、生物化学、组织形态学、分子生物学、蛋白质组学、生物信息学、网络药理学等多层次、多角度系统研究航天郁证的病理生理改变和发病机制。
　　3.首次对航天郁证进行中医药防护作用和机制研究，发现保元解郁方具有减轻抑郁样反应、调节神经和内分泌、抗氧化、调节神经递质和减轻神经元损伤等药理作用，明确了下调MAPK通路和上调神经营养因子通路是其发挥抗郁作用的机制之一。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 慢性应激、抑郁症与郁证

2 航天中的心理问题研究

第一部分 保元解郁方对模拟航天郁证大鼠行为学的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 保元解郁方对模拟航天郁证大鼠血浆生化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 保元解郁方对模拟航天郁证大鼠脑神经递质水平的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 保元解郁方对模拟航天郁证大鼠脑组织形态的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五部分 保元解郁方对模拟航天郁证大鼠皮层和海马蛋白表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第六部分 保元解郁方方解及网络药理学分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

结论

创新点

展望

参考文献

个人简历和研究成果

谢