一氧化碳在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

摘要

研究背景：
　　随着肝移植技术的日益成熟，供肝短缺已成为比移植后排斥反应、外科并发症以及感染更为严峻的全球性问题，由此导致边缘性供肝的使用逐渐增加[1]。但是，边缘性供肝对缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）极其敏感，导致此类肝移植受者的预后很差[2]，严重时可危及患者生命。目前许多针对IRI的防治方法效果均有限，难以满足临床需求，因此需要寻找针对肝脏IRI新型的更为有效的治疗方案。一氧化碳（Carbon monoxide，CO）是一种十分重要的细胞信使分子，具有抗炎、抗凋亡等作用，最近的研究发现 CO可能还参与影响细胞的自噬过程。目前关于自噬在肝脏IRI中的作用方式尚不明确，其具体机制研究较少。
　　目的：
　　本实验利用体外肝实质细胞低浓度血清培养和缺氧复氧模型，以及体内肝脏缺血再灌注损伤模型，深入探讨可溶性一氧化碳释放分子CORM-2在肝脏IRI中的作用及可能的新机制。
　　方法：
　　1.模拟严重肝损伤时的缺血微环境，在体外建立肝前体细胞WB-F344低浓度（4％）血清培养模型，探讨CORM-2治疗对WB-F344细胞活性和增殖的影响，初步研究在应激环境中自噬对肝实质细胞的作用。实验分为五组：10%FBS组；4%FBS组；4%FBS+iCORM-2组;4%FBS+CORM-2组以及4%FBS+CORM-2+3-MA组。CCK-8检测细胞活力和增殖情况；吖啶橙染色检测自噬小体的形成情况；Western-Blot检测AKT、p-AKT、p-mTOR、HO-1、自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II的表达情况；
　　2.分离原代大鼠肝细胞，在体外检测CORM-2治疗对肝细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的影响，并探讨自噬在肝细胞H/R中的作用。实验分为四组：DMSO空白对照组；无活性iCORM-2阴性对照组；CORM-2实验组以及CORM-2+3-MA自噬抑制组。采用两步胶原酶灌注法分离细胞，观察原代大鼠肝细胞贴壁情况，台盼蓝染色检测细胞活性状态，取生长状态良好的原代肝细胞，在体外缺氧条件下培养4小时，并经历复氧过程。收集各组细胞培养液上清，用全自动生化仪检测细胞培养上清中的谷草、谷丙转氨酶指标变化评价细胞损伤程度；Western-Blot检测自噬相关蛋白LC3-I和LC3-II的表达，判断细胞自噬水平改变；
　　3.建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型，在体内检测CORM-2治疗对肝脏IRI的影响。实验随机分为Sham组和IRI组，每组分别给予Vehicle和CORM-2治疗。大鼠术前禁食，在环境温度26℃下，Sham组仅做腹部切开，立即取血样和肝脏标本；IR I组应用显微血管夹阻断肝左、肝中叶脉管的血供，造成肝左叶与肝中叶缺血，即70%肝组织缺血。IRI组血流阻断1h后开放，分别于恢复血流后1h和6h处死大鼠，并留取血样和肝脏标本。全自动生化仪检测谷丙、谷草转氨酶变化评价肝功能变化。肝组织行HE和TUNEL染色评价肝损伤程度；实时定量PCR检测组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达变化评价组织炎性反应；Western-Blot测定LC3-I和LC3-II蛋白的表达情况，评价组织自噬活性；
　　4.利用自噬抑制剂3-MA联合CORM-2治疗，反向验证自噬在肝脏IRI中的作用。重建大鼠70%肝脏IRI模型，于术前1h静脉给予3-MA联合CORM-2治疗，对照组仅给予CORM-2。于恢复血流后6h处死大鼠，留取血样和肝脏标本，检测谷丙和谷草转氨酶变化评价肝功能；肝组织行 HE染色检查评价组织损伤程度；Western-Blot测定LC3-I和LC3-II蛋白的表达变化，检测组织自噬发生情况。
　　结果：
　　1.4%FBS培养条件下，WB-F344细胞生长相对缓慢，细胞活性和增殖能力下降；CCK-8结果提示CORM-2治疗能提高WB-F344细胞活性，促进其增殖；吖啶橙染色显示，CORM-2治疗使胞质内橘红色荧光增强，提示细胞自噬小体形成活跃；同时 Western-Blot结果显示 p-AKT、p-mTOR表达下调， HO-1蛋白表达增加， LC3-II/LC3-I的比值显著增大；3-MA干预后，CORM-2治疗效果被逆转。
　　2.原代分离的大鼠肝细胞状态良好，24小时后细胞均实现贴壁，台盼蓝染色显示细胞存活率达90%以上。在缺氧/复氧培养条件下，细胞培养上清中可检测到谷丙和谷草转氨酶释放，提示细胞出现明显应激损伤；在给予CORM-2治疗后，生化检测发现培养上清中谷丙和谷草转氨酶释放减少，同时Western-Blot结果显示LC3-II的表达增加，而LC3-I的表达下调；3-MA干预后，CORM-2治疗效果被逆转。
　　3.大鼠肝脏经历缺血再灌注后出现严重的肝功能损害，血清谷丙和谷草转氨酶水平明显升高；CORM-2预处理使再灌注后1h和6h两个时间点的谷丙、谷草转氨酶水平明显降低，提示肝功能损伤程度减轻；组织学检查发现IRI可使肝实质细胞发生凋亡坏死，而CORM-2治疗可显著减轻肝组织中的细胞凋亡；实时定量PCR发现， IRI肝组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达上调，而给予CORM-2治疗后其表达水平降低；Western-Blot结果提示CORM-2治疗可使LC3-II的表达增高， LC3-II/LC3-I的比值显著增大。
　　4.同CORM-2组比较，给予自噬抑制剂3-MA联合CORM-2治疗后，血清中谷丙和谷草转氨酶出现反跳升高，提示CORM-2的肝脏保护作用被解除；组织学检查亦证实，3-MA可导致肝组织炎性反应加重，肝实质细胞坏死增多；Western-Blot结果显示3-MA处理后自噬相关蛋白LC3-II表达降低，而LC3-I分子表达增高，自噬被抑制。
　　结论：
　　一氧化碳释放分子CORM-2通过释放CO有利于维持应激环境下WB-F344细胞的活性和增殖能力；同时，CORM-2治疗可减轻体外培养大鼠肝细胞的缺氧/复氧损伤；此外，CORM-2可在体内环境中减轻肝组织缺血再灌注损伤，发挥肝脏保护作用。其机制可能是通过抑制AKT/mTOR信号轴，诱导细胞产生自噬，抑制细胞凋亡，而HO-1可能也参与了此过程。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、缺血再灌注损伤

二、细胞自噬

三、自噬在肝脏中的基本功能

四、自噬在肝缺血再灌注损伤中的作用

五、CO与肝脏缺血再灌注损伤

第一部分 一氧化碳释放分子对大鼠肝前体细胞模拟缺血缺氧条件下活性和增殖功能的影响

引言

1 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分 一氧化碳释放分子对缺氧/复氧条件下肝细胞活性和稳态的保护作用

引言

1 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第三部分 一氧化碳释放分子对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

引言

1 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第四部分 一氧化碳释放分子对大鼠肝脏IRI的保护作用与其增强细胞自噬活性有关

引言

1 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢