西维来司他钠在大鼠急性脊髓损伤中的治疗作用及机制研究

摘要

背景：急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)是一类由于外伤而导致的，并且具有高致残性的中枢神经创伤，是临床上常见的严重中枢神经系统创伤之一，损伤往往导致脊髓结构破坏和脊髓功能的障碍甚至缺失。脊髓损伤主要由各类事故、体育运动、自然灾害、跌落及暴力所造成,其发生率一直居高不下。损伤多见于男性青壮年，最常发生于16-30岁的年轻人，其中以胸腰段损伤最多。目前急性脊髓损伤早期药物治疗主要以糖皮质激素甲基强的松龙的早期冲击治疗为主，但甲基强的松龙的冲击治疗可明显增加高血糖、低血钙、消化性溃疡等一系列并发症的发生，同时该方案并没有降低急性脊髓损伤的两周死亡率。因此，积极开发和寻找急性脊髓损伤早期治疗药物就成为了在临床上需要解决的一个有重要意义的问题。 原发性脊髓损伤是指外力直接或间接作用于脊髓后，损伤中心在损伤后的第一周内形成坏死空腔。机械性的损伤同时会导致严重的继发性损伤，如血脑屏障破坏导致外周炎症细胞浸润，大量中性粒细胞迁移并浸润到脊髓灰质，中性粒细胞的过度活化，释放大量氧自由基、弹性蛋白酶、炎症因子等活性物质，引起损伤组织渐进性坏死。然而，神经细胞的凋亡的主要原因是由于继发性脊髓损伤引起的，因而对于继发性脊髓损伤的干预也成为急性脊髓损伤治疗的主要靶点。 新近研究表明，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde–3– phosphate dehydrogenase，GAPDH）和E3泛素连接酶蛋白1（Siah E3 ubiquitin protein ligase1， Siah1）是近年来发现的诱发细胞凋亡的重要蛋白质，二者结合后发生核转移，可以诱发神经细胞的凋亡；此序列也是脊髓神经元损伤后调节凋亡的关键细胞信号分子。它的激活是中枢神经系统发生凋亡的关键因素。当遭受严重创伤、感染等外界因素刺激机体时，适量中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil Elastase，NE）可对机体产生的炎症反应起到抑制作用。但如果外伤后，产生过量 NE，它不仅破坏器官组织间弹性蛋白，而且它还对细胞间紧密连接起到不同程度的破坏，同时还激活多核中性粒细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）释放更多的NE，导致恶性循环。近年来，有较多的学者研究了NE在急性肺损伤（acute lung injury，ALI）中的作用，其作用受到了广泛的关注和重视，相关研究证实 ALI中积极使用中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂（Neutro phil Elast ase Inhibitors，NE I)，能够抑制由于炎症引起的肺组织过度损伤，有效改善肺损伤程度，提高生存率。西维来司他钠作为中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，是目前唯一应用于临床的抑制中性粒细胞功能的药物。国内外研究发现，西维来司他钠可以显著减少肝脏、心肌、脊髓等器官组织损伤后中性粒细胞的大量浸润，一方面，减少各种炎性介质的级联反应，另一方面，抑制NE的活性，有助于改善能量代谢障碍的改善，减轻组织器官损伤。但国内外西维来司他钠治疗急性脊髓损伤鲜有报道。 因此，本研究以大鼠脊髓损伤模型为基础，验证西维来司他钠的脊髓保护作用及其对脊髓损伤后炎症反应的影响；并深入探讨抗凋亡该药物对损伤脊髓抗凋亡作用机制。 第一部分：西维来司他钠在大鼠急性期脊髓损伤中保护作用的研究 目的：探讨西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤的治疗作用及剂量效应关系。 方法：雄性SD大鼠（300-350g），随机分为5组（n=10）：①假手术组(Sham)：单纯咬除T7-T9椎板和棘突；②对照组(Control)：急性脊髓损伤模型组；咬除T7-T9椎板和棘突后采用 Allen’ s法行脊髓损伤。SD大鼠，雄性，0.3ml/100g水合氯醛（IP）进行麻醉，大鼠麻醉后，俯卧位，将其四肢分别温柔地固定与手术操作台上。以T8为中心做好标记，并分别向上向下触摸棘突以确认其位置。手术部位消毒，铺无菌洞巾，以T8为中心，正中入路逐层切开皮肤、筋膜、肌肉，剥离椎旁棘突所附着的相关肌肉以及韧带，使得 T7-T9棘突充分暴露。用镊子轻轻将 T6和 T10棘突提起，使T7-T9段棘突突出于其它棘突表面，仔细查找T7-T9椎板间隙，找到后，轻柔从椎板间隙缓缓进探查，剪开相应的椎板，将 T7-T9段棘突向上提拉，并掀除T9–T11段棘突以及相应的椎板，充分暴露T10脊髓及T9和T11段脊髓背侧的硬脊膜，并保证硬脊膜完整性，选用自制的大鼠脊髓打击装置。将一根不锈钢金属棒放置于透明的玻璃套管内，在离硬脊约25mm高处，金属棒自由垂直落下直击T10段脊髓硬脊膜，造成T8段脊髓的冲击外伤，金属棒撞击后用常温的生理盐水清洗相应的损伤脊髓节段。造模后，青霉素8万U进行椎旁肌肉肌注，目的是为了预防感染，用常温生理盐水将局部冲洗干净，依次将肌肉、筋膜、皮肤等进行缝合，术毕在缝合部位进行认真消毒，大鼠送保暖箱等待苏醒。③西维来司他钠（1.6mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠1.6mg/kg；④西维来司他钠（4.8mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠4.8mg/kg；⑤西维来司他钠（10mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠10mg/kg。采用 BBB评分(Basso Beattie& Bresnahan rating scale，BBB scale)，对大鼠行双下肢神经功能评分。取大鼠脊髓组织（T7-T9），行HE染色。光镜下观察脊髓损伤地震带的神经元。TUNEL检测大鼠脊髓损伤地震带脊髓神经元的凋亡情况。 结果：①神经功能学评分：脊髓损伤后第1d、3d，各组下肢运动功能无明显区别（P>0.05）。损伤后7d、14d和21d，不同剂量西维来司他钠治疗组的神经功能评分(BBB)在各时间点均显著高于对照组(P<0.05)，且西维来司他钠4.8mg/kg和10mg/kg剂量组 BBB评分又明显高于西维来司他钠（1.6mg/kg）组(P<0.01)，而西维来司他钠4.8mg/kg和10mg/kg剂量组之间BBB评分无显著差异（P>0.05）。②组织学观察：对照组大鼠的脊髓神经元严重损伤，灰质空泡化变性，核固缩，见少量正常神经元。与对照组相比，西维来司他钠各治疗组损伤损伤地震带中心部位存活神经元明显多于对照组。与西维来司他钠1.6mg/kg组，西维来司他钠4.8mg/kg组和10mg/kg组：存活神经元明显多于西维来司他钠1.6mg/kg组；③TUNEL检测：对照组脊髓灰质内可见大量凋亡神经元，与对照组相比，西维来司他钠各治疗组凋亡神经元显著减少。与西维来司他钠1.6mg/kg组相比，西维来司他钠4.8mg/kg组和10mg/kg组凋亡神经元明显减少。西维来司他钠4.8mg/kg组和10mg/kg组之间无显著差异。 结论：西维来司他钠可抑制脊髓损伤后神经元的凋亡，改善脊髓损伤大鼠后运动神经功能，且治疗效果呈明显剂量效应关系。 第二部分：西维来司他钠在大鼠急性脊髓损伤中保护作用的机制研究 实验一：西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤后炎性细胞因子表达的影响 目的：探讨西维来司他钠在大鼠急性脊髓损伤后炎症反应的影响。 方法：雄性SD大鼠（300~350g），随机分为3组：①对照组(Control)：脊髓损伤模型组；②西维来司他钠（1.6mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠1.6mg/kg；③西维来司他钠（4.8mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠4.8mg/kg。脊髓损伤后24h，取脊髓组织（T7-T9），ELISA检测细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子–α（tumor necrosis factor–alpha，TNF-α）、核因子NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及中性粒细胞髓过氧化物酶（myel operoxidase， MPO）活性。 结果：与对照组相比，脊髓损伤后给予西维来司他钠1.6mg/kg和4.8mg/kg后，IL-1β、TNF-α、NF-κB、表达水平及MPO活性显著降低（P<0.05）。与西维来司他钠1.6mg/kg相比，脊髓损伤后给予西维来司他钠4.8mg/kg，IL-1β、TNF-α、NF-κB、MPO表达水平显著降低（P<0.05）； 结论：西维来司他钠可显著抑制脊髓损伤后IL-1β、TNF-α, NF-κB及表达水平及MPO活性表达水平。 实验二：大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1表达的变化 目的：探讨大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1在细胞核内蛋白表达的变化。 方法：雄性 SD大鼠（300-350g），随机分为2组：①假手术组(Sham)：单纯咬除T7-T9椎板和棘突；②对照组（CON）：脊髓损伤模型组。脊髓损伤后2h、4h、12h、24h、72h取脊髓组织（T7-T9）采用WB检测损伤脊髓GAPDH和Siah1蛋白表达的变化。 结果：与Sham组相比，脊髓损伤后2h、4h、12h、24h和72h，Con组GAPDH和Siah1的蛋白表达水平显著增高（P<0.05）,24h达高峰。 结论：大鼠急性脊髓损伤后，细胞凋亡调节蛋白GAPDH和Siah1蛋白的核内表达显著增加。 实验三：西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1表达变化的影响 目的：探讨西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1表达变化的影响。方法：GAPDH和Siah1mRNA 雄性SD大鼠（300~350g），随机分为4组：①假手术组(Sham)：单纯咬除T7-T9椎板和棘突；②对照组(Control)：急性脊髓损伤模型组；③西维来司他钠（1.6mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠1.6mg/kg；④西维来司他钠（4.8mg/kg）组：急性脊髓损伤后，即刻腹腔注射西维来司他钠4.8mg/kg；脊髓损伤后24h取脊髓组织（T7-T9），采用WB检测和RT-PCR法检测GAPDH和Siah1蛋白及mRNA水平表达变化。 结果：①GAPDH和Siah1蛋白表达：与Sham组相比，脊髓损伤后GAPDH和Siah1的表达水平显著增高（P<0.05）；与Con组相比，西维来司他钠各治疗组可显著下调脊髓损伤后GAPDH和Siah1蛋白的表达（P<0.05）。与西维来司他钠1.6mg/kg组，西维来司他钠4.8mg/kg能显著下调脊髓损伤后 GAPDH和 Siah1蛋白的表达（P<0.05）。 ②GAPDH和Siah1mRNA表达：与Sham组相比，脊髓损伤后GAPDH和Siah1的mRNA表达水平显著增高（P<0.05）；与Con组相比，西维来司他钠组可显著下调脊髓损伤后GAPDH和Siah1的mRNA的表达（P<0.05）。 结论：西维来司他钠能显著降低大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1的mRNA与核内蛋白表达。 小结： 西维来司他钠可显著改善大鼠ASCI后的神经功能学（BBB）评分，抑制神经元的凋亡、增加神经元的存活，且治疗效果呈明显剂量效应关系。说明西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤具有治疗作用。 急性脊髓损伤后，细胞因子IL-1β、TNF-α, NF-κB及MPO的表达水平显著增高，西维来司他钠可显著抑制脊髓损伤后IL-1β、TNF-α, NF-κB的表达水平及MPO活性。其主要机制是可能与西维来司他钠抑制脊髓损伤后中性粒细胞功能相关。 急性脊髓损伤后，损伤区域细胞核内GAPDH与Siah1结合增强，诱导了细胞凋亡的发生。损伤后即刻给予西维来司他钠可显著下调脊髓损伤后GAPDH和Siah1蛋白的表达。提示西维来司他钠可能通过抑制

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缩略语表

前言

文献回顾

第一部分 西维来司他钠在大鼠急性期脊髓损伤中的保护作用

1.材料

2.方法

3.结果

第二部分：西维来司他钠在大鼠急性脊髓损伤中保护作用机制的探讨

实验一 西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤后细胞因子的影响

实验二 大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1蛋白表达的变化

实验三 西维来司他钠对大鼠急性脊髓损伤后GAPDH和Siah1表达变化的影响

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢